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房顫(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見(jiàn)的心律失常之一，研究者認(rèn)為心房重塑的早期改變，主要是心房電重構(gòu)。心臟組織片電活動(dòng)較單個(gè)心肌細(xì)胞更接近生理狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)微電極陣列芯片(microelectrode arrays chip，MEA)技術(shù)對(duì)AF犬心耳組織片60個(gè)位點(diǎn)同步、動(dòng)態(tài)記錄并通過(guò)整體組織片水平記錄AF犬心房組織的電生理變化，探索其基本的電生理特性。
1材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組
隨意來(lái)源犬12只，體重(18±2.64)kg，年齡1～1.5歲，雌雄不限，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(新)2010-0001】。分為48 h AF組(n=6)和對(duì)照組(n=6)。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及實(shí)施均通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)審核，符合中國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的福利倫理準(zhǔn)則，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷(審批號(hào):A-20100310013)。
1.2主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備和溶液
Aaeon7200A呼吸麻醉機(jī)(北京誼安醫(yī)療系統(tǒng)股份有限公司);LEAD-2000電生理儀(四川錦江電子科技，中國(guó));DF-4A型心臟電生理刺激儀(蘇州中國(guó)東方電子儀器廠，中國(guó));微電極陣列芯片系統(tǒng)(MEA，德國(guó))，MEA1060放大器，刺激儀，溫控儀。
正常臺(tái)氏液組成:NaCL 140 mmol/L、KCL 4 mmol/L、MgCl2l mmol/L、CaCl2l mmol/L、Hepes l0 mmol/L、葡萄糖1 g，NaOH滴定將pH值校至7.36，采用超純水配制。實(shí)驗(yàn)前37℃孵育，使用前1 h充100%氧飽和。
1.3快速心房起搏AF模型的建立
隨意來(lái)源犬術(shù)前12 h禁食，6 h禁飲。肌注氯胺酮(20 mg/kg)基礎(chǔ)麻醉后以3%的戊巴比妥鈉(20 mg/kg)靜脈注射維持麻醉。氣管插管，必要時(shí)呼吸機(jī)輔助呼吸，調(diào)節(jié)氧流量4～6 L/min，潮氣量為10 mL/kg，呼吸壓力0～2 kPa。連接lead-2000電生理儀，以II導(dǎo)聯(lián)作為監(jiān)護(hù)導(dǎo)聯(lián)，肝素化(300 U/kg)。股動(dòng)脈接入壓力換能器連于監(jiān)護(hù)儀記錄血流動(dòng)力學(xué)變化。造模過(guò)程中持續(xù)監(jiān)測(cè)體溫、心率、心律、血壓、血氧飽和度、血電解質(zhì)等指標(biāo)，并根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果予以輸液、吸氧、補(bǔ)鉀、抗感染等支持。
由股靜脈置入2極電極導(dǎo)管至右心室記錄心內(nèi)電生理圖，供緊急起搏用，當(dāng)監(jiān)視儀上顯示為大V波無(wú)A波時(shí)，表示置管成功。由右側(cè)頸外靜脈置入4極電極導(dǎo)管于右心房，當(dāng)心內(nèi)電圖記錄為大A波無(wú)V波時(shí)，置管成功。以周長(zhǎng)100 ms行S1S1刺激，2倍的閾值刺激電壓刺激右心房，1～5 min后AF圖形出現(xiàn)，持續(xù)起搏48 h。對(duì)照組只置入電極48 h不行心房起搏。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，未有惡性心律失常發(fā)生、未有心力衰竭、一只犬AF36 h后因肺栓塞死亡，后又補(bǔ)充一只AF犬，共有12只犬完成實(shí)驗(yàn)，標(biāo)注造模的成功率為91.6%。
1.4心臟標(biāo)本的制備及固定
犬快速起搏48 h后，迅速開胸取心，分別切取約5～8 mm2大小全層左心耳(left atrial appendage，LAA)、右心耳(right atrial appendage，RAA)，置于4℃充氧改良臺(tái)式液中。用銀絲制成O形框架，將尼龍絲粘附在O型框架上制成蓋網(wǎng)，并用蓋網(wǎng)將組織標(biāo)本固定于MEA電極上。
1.5微電極陣列系統(tǒng)記錄LAA和RAA場(chǎng)電位
分別將LAA、RAA置于MEA-1060-AMP的MEA芯片(圖1，彩插5)，由TCO2溫控儀調(diào)整溫度在37℃。將電極芯片中注入2 mL改良臺(tái)式液灌流LAA、RAA，與TCO2溫控儀、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)等相連接。標(biāo)本置入電極前，放大器和溫控儀先預(yù)熱30 min，待標(biāo)本放入且信號(hào)穩(wěn)定后開始記錄LAA及RAA組織場(chǎng)電位(field action potential，F(xiàn)AP)。
從MEA電極芯片60個(gè)通道同步獲取的心電信號(hào)通過(guò)MEA-1060-AMP放大(單端放大，每個(gè)通道均為雙極記錄，兩電極間的距離為700μm，直徑100μm。帶寬10～3400 Hz;放大倍數(shù)為1200倍;輸入阻抗大于1010Ω，輸出阻抗330Ω)，通過(guò)MC-Rack 4.01軟件對(duì)心電活動(dòng)信號(hào)采樣。采樣信息實(shí)時(shí)顯示于工作站顯示屏，可儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)，以備在線或離線分析(圖2，彩插5)。
1.6 MEA場(chǎng)電位檢測(cè)指標(biāo)
場(chǎng)電位的分析有如下參數(shù):FPmin是場(chǎng)電位的第一個(gè)負(fù)向峰值，即最小場(chǎng)電位;FPmax是場(chǎng)電位最后一個(gè)正向波峰值，即最大場(chǎng)電位;FPdur為FPmin和FPmax之間的間期。可見(jiàn)場(chǎng)電位類似與細(xì)胞的動(dòng)作電位，其場(chǎng)電位時(shí)程和動(dòng)作電位及心電圖的QT間期相對(duì)應(yīng)，因此能反映細(xì)胞的除極和復(fù)極時(shí)間(圖3，彩插5)。
圖1微電極陣芯片標(biāo)測(cè)系統(tǒng)
圖2實(shí)驗(yàn)流程圖
圖3場(chǎng)電位形態(tài)及FP的測(cè)量和檢測(cè)指標(biāo)
1.7 MEA記錄兩組犬LAA，RAA組織塊電激動(dòng)傳導(dǎo)順序
在心耳組織片同一記錄平面，各微電極接觸心耳組織所記錄場(chǎng)電位信號(hào)的電壓和時(shí)間差異，信號(hào)電壓最大窗口和最早出現(xiàn)的窗口一般為最早激動(dòng)和激動(dòng)起源點(diǎn)處，利用MC-Rack分析軟件，根據(jù)peakpeak amplitude的變化可繪制出場(chǎng)電位激動(dòng)順序圖。可見(jiàn)從黑色到紅色到黃色到白色，代表0～400μV，電壓越大顏色越趨向于白色，代表激動(dòng)越早，電壓越小，越向于黑色，代表激動(dòng)越晚。
