研究簡介:研究表明，絕經前女性的心臟病發病率低于同齡男性，但這種性別優勢在女性絕經后消失，這提示內源性雌激素可能具有心臟保護作用。雌激素已被證實具有多種生物學效應，其中抗氧化應激是與心臟保護相關的關鍵效應之一。雌激素能夠減少心肌中的活性氧種類生成，并通過抑制缺血/再氧合誘導的氧化應激來減少細胞凋亡。硫化氫（H2S）作為一種新發現的氣體信號分子，硫化氫在心肌中主要由CSE合成，并且已被證明具有心臟保護作用，其機制之一是抗氧化應激。之前的研究表明，雌激素治療能夠改善氧化應激，恢復因去卵巢手術導致的大鼠心肌中CSE表達和硫化氫生成的降低，提示雌激素可能通過維持心肌中CSE的表達來保護心肌細胞免受氧化應激的損害。

本研究旨在證實CSE有助于17β-雌二醇(E2)對心肌細胞氧化應激的心臟保護作用，并闡明亞型雌激素受體在E2對CSE的調控中的作用。由于Sp-1與多種細胞中CSE的調控有關，而已知雌激素可調控心肌中的多種miRs，因此研究人員進一步確定Sp-1是否介導了雌激素對CSE的調控，并確定心肌中調控CSE的miRs。

Unisense微呼吸系統的應用

使用微型硫化氫微呼吸瓶(型號H2S-MRCh；Unisense)和Unisense PA2000放大器測量了原代培養的大鼠新生心肌細胞產生硫化氫的實時動力學。收集心肌細胞并在不含FBS的培養基中清洗，培養基中用20mM HEPES代替碳酸氫鈉，以防止封閉的微呼吸瓶腔室(Unisense)中形成二氧化碳氣泡。最終細胞團以1×107個細胞/毫升的濃度重懸，并將0.1毫升細胞懸液注入呼吸瓶。此外，為避免硫化氫自發氧化，在加入心肌細胞之前，用氮氣對呼吸室中的培養基進行脫氧。微電極信號穩定后，加入L-半胱氨酸(1mmol/L，CSE的底物)和5-磷酸吡哆醛(1mmol/L，CSE的輔助因子)以刺激硫化氫生成。在添加底物和輔助因子后，在每個跡線的最初最陡斜坡處測定硫化氫生成率。細胞活力通過胰藍排除法進行評估，在整個實驗過程中，細胞活力保持在90%以上。每次實驗后，根據制造商的手冊，使用與實驗相同的緩沖液和條件，用新鮮制備的缺氧硫化鈉原液(0-100μmol/L)校準硫化氫微電極。

實驗結果

研究發現雌激素17β-雌二醇（E2）通過與雌激素受體α（ERα）結合，在體外培養的心肌細胞和雌性小鼠體內上調了CSE的表達。E2能夠降低心肌細胞中miR-22的表達。miR-22是一種微小RNA，能夠靶向ERα和Sp-1，調控它們的表達水平。E2通過降低miR-22的表達，間接促進了特異性蛋白-1（Sp-1）的表達。Sp-1是一種轉錄因子，能夠結合到CSE基因啟動子區域的保守位點上，從而促進CSE基因的轉錄和表達。由于Sp-1的上調，CSE基因的表達得到了增強，導致心肌細胞中硫化氫的產生增加。硫化氫的增加有助于提高心肌細胞的抗氧化防御能力，從而保護心肌細胞免受氧化應激的損傷。E2通過上述機制，增強了心肌細胞對H2O2和缺氧/再氧合（H/R）誘導的損傷的抵抗力，顯示出心臟保護作用。揭示了雌激素在性別差異心臟病發病率中可能發揮的分子機制，尤其是在絕經前女性中觀察到的較低心臟病發病率。

圖1、CSE抑制劑減弱E2介導的原代培養新生大鼠心肌細胞氧化應激保護作用。在無CSE抑制劑(PAG，1mmol/L)或有CSE抑制劑存在的情況下，用E2(10nmol/L)培養細胞24小時。然后將細胞暴露于H2O2(200μmol/L)中4小時。通過MTT(A)和上清液LDH濃度(B)評估細胞的整體存活率。通過Western blot分析確定裂解的Caspase-3(C)和磷酸化的Akt(D)水平。

圖2、CSE siRNA可減弱E2-介導的原代培養新生大鼠心肌細胞氧化應激保護作用。用對照siRNA或CSE siRNA預處理細胞24小時，然后用或不用E2(10nmol/L)孵育24小時。A-D，然后將細胞暴露于H2O2(200μmol/L)4小時。E-H，然后將細胞放入厭氧室，用92%N2、5%CO2和3%O2凈化24小時，然后復氧2小時。通過MTT(圖A和E)和上清液LDH濃度(圖B和F)評估整體細胞活力。通過Western印跡法測定裂解的Caspase-3(圖C和圖G)和磷酸化的Akt(圖D和圖H)水平。

圖3、E2在原代培養的新生心肌細胞中介導E2對CSE表達的調節。A，用指定劑量的E2刺激細胞24小時。采用定量實時RT-PCR和Western印跡分析分別測定心肌細胞(n=4)中CSE mRNA和蛋白的表達。B，用E2(10nmol/L)刺激細胞24小時。實時硫化氫生成測量用于確定硫化氫生成率，如材料和方法中所述(n=3)。C，在無或有非特異性ER拮抗劑ICI 182780(1μmol/L)、ERα特異性拮抗劑MPP(1μmol/L)或ERβ特異性拮抗劑THC(1μmol/L)的情況下，用E2(10nmol/L)處理細胞24小時。定量實時RT-PCR和Western印跡分析分別用于測定心肌細胞(n=4)中CSE mRNA表達和蛋白表達。D，用對照siRNA或ERαsiRNA轉染細胞24小時，然后用E2(10nmol/L)處理24小時。采用實時RT-PCR定量分析和Western印跡分析分別測定心肌細胞中CSE mRNA表達和蛋白表達(n=4)。E，對雌性小鼠進行雙側卵巢切除術以清除內源性雌激素。外源性E2和ERα選擇性激動劑(PPT)和ERβ選擇性激動劑(DPN)均持續給藥4周。采用Western印跡分析測定心肌中CSE蛋白的表達(每組8人)。

圖4、Sp-1在大鼠心肌細胞中介導E2對CSE的上調。A，蛋白合成抑制劑(CHX)對E2誘導的CSE mRNA表達的影響。用CHX(10μmol/L)預處理原代培養的新生心肌細胞1小時，然后用E2(10nmol/L)刺激24小時。通過實時RT-PCR定量評估CSE mRNA的穩態水平。B、E2對Sp-1表達的影響。用指定劑量的E2處理原代培養的新生兒心肌細胞24小時。定量實時RT-PCR和Western印跡分析分別用于檢測Sp-1mRNA表達和蛋白表達。C，ERα介導E2誘導的Sp-1表達。用對照siRNA或ERαsiRNA轉染原代培養的新生兒心肌細胞24小時，然后用E2(10nmol/L)處理24小時。D，Sp-1在E2上調CSE表達中的作用。用對照siRNA或Sp-1 siRNA轉染原代培養的新生兒心肌細胞，然后用E2(10nmol/L)處理24小時。E，E2對大鼠CSE啟動子活性的影響。用大鼠CSE啟動子-熒光素酶報告構建體pGL3-CSE或突變構建體pGL3-CSE SP1轉染H9c2細胞，然后暴露于E2 24小時。使用雙熒光素酶報告實驗分析啟動子活性。實時定量RT-PCR和Western印跡分析分別用于測定CSE或Sp-1 mRNA表達和心肌細胞蛋白表達(n=4)。

圖5、E2療法對卵巢切除大鼠心肌中miR22、ERα和Sp-1表達的影響。對雌性大鼠進行雙側卵巢切除術，以消耗內源性雌激素。外源性E2給藥8周。定量實時RT-PCR和Western印跡分析分別用于測定miR-22的表達(A)以及ERα和Sp-1的蛋白表達(B)。條形圖內的圓圈表示每組的人數。所有條形圖均代表平均±SEM，代表性的Western印跡條帶位于相應圖的頂部。D，用線性回歸法分析miR-22與Sp-1水平的相關性。E，線性回歸法分析ERα與Sp-1水平的相關性。

結論與展望

硫化氫主要通過胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)在心肌中產生，具有心臟保護作用。前期的研究表明，雌激素可以增強雌性大鼠心肌中CSE的表達。本研究旨在探討雌激素調節CSE表達的機制，特別是闡明雌激素受體亞型的作用以及負責雌激素作用的轉錄因子。研究發現CSE抑制劑或CSE小干擾RNA減弱了17β-雌二醇(E2)對原代培養的新生兒心肌細胞中H2O2-和缺氧/復氧引起的損傷的保護作用。E2在體外培養的心肌細胞和體內雌性小鼠的心肌中通過雌激素受體(ER)-α刺激CSE表達。在大鼠CSE啟動子中鑒定出特異性蛋白1(Sp-1)共有位點，并發現該位點介導E2誘導的CSE表達。E2增加卵巢切除大鼠心肌中ERα和Sp-1的表達并抑制microRNA(miR)-22的表達。在原代心肌細胞中，E2通過ERα介導的miR-22下調來刺激Sp-1表達。已證實ERα和Sp-1都是miR-22的靶標。在卵巢切除大鼠的心肌中，miR-22的水平與CSE、ERα、Sp-1和抗氧化生物標志物呈負相關，與氧化生物標志物呈正相關。使用Unisense微呼吸測量系統，研究人員能夠準確地測量和分析硫化氫的產生，這對于理解雌激素對心臟的保護機制以及CSE在其中的作用至關重要。總之本研究表明，雌激素通過ERα介導的心肌細胞miR-22下調來刺激Sp-1，導致CSE上調，進而導致抗氧化防御增強。ERα、miR-22和Sp-1的相互作用可能在雌性大鼠心肌氧化應激狀態的控制中發揮關鍵作用。