研究簡介:PGDH是一種關鍵的酶，負責控制子宮內前列腺素的水平，而前列腺素在分娩的生理過程中起到至關重要的作用。硫化氫是一種內源性的氣體信號分子，參與了許多生理和病理過程，但其在分娩過程中的確切作用尚不明確。確定了硫化氫生成酶，包括半胱氨酸β-合成酶（CBS）和半胱氨酸γ-裂解酶（CSE），在人類蛻膜中的表達，并發現在分娩期間，無論是足月還是早產，這些酶的表達量都有所下降。此外研究還發現硫化氫的產生率在分娩期間也有所降低，并且CBS的表達水平與PGDH的表達呈正相關。為了進一步探究硫化氫對PGDH表達的影響，研究者們使用了硫化氫供體NaHS和硫化氫前體L-半胱氨酸來處理蛻膜滋養層細胞，并觀察到PGDH的表達和活性隨之增加。研究揭示了miR-26b和miR-199a這兩種微小RNA在硫化氫上調PGDH表達中的作用，硫化氫能夠抑制這兩種微小RNA的表達，而這兩種微小RNA的模擬物能夠阻斷硫化氫對PGDH表達的上調作用。本研究提供了硫化氫在維持妊娠期間蛻膜中PGDH表達穩定性中的關鍵作用的證據，并指出硫化氫生成酶表達的降低可能導致分娩期間子宮內前列腺素水平的增加，這可能與早產的發生有關。

Unisense硫化氫微電極系統的應用

將約100mg的胎盤組織放入含有蛋白酶抑制劑(2mmol/L苯基甲基磺酰氟、1mmol/L正釩酸鈉和10μg/mL阿普丁)的磷酸鹽緩沖液中，置于冰上。將組織勻漿并在4℃下離心，然后收集上清液。使用微型硫化氫微呼吸電極(型號H2S-MRCh；Unisense，丹麥)和Unisense PA2000放大器測定硫化氫產生的實時動力學。測量是在溫控微呼吸室(Unisense)中進行的。傳感器信號穩定后，加入L-半胱氨酸(1毫摩爾/升)和生成硫化氫的輔助因子吡哆醛-5’-磷酸(1mmol/L)。然后在每個痕量的最初最陡斜坡處測定硫化氫產生率。

實驗結果

硫化氫在妊娠期間維持蛻膜中PGDH表達穩定性的關鍵作用。研究顯示在足月和早產期間，蛻膜中硫化氫生成酶CBS和CSE的表達量降低，與非分娩期相比，硫化氫的產生率也有所下降。這種下降與PGDH表達的降低有關，暗示硫化氫生成酶的活性可能對PGDH的水平有直接影響。硫化氫供體NaHS和硫化氫前體L-半胱氨酸能夠在培養的蛻膜滋養層細胞中劑量依賴性地增加PGDH的表達和活性。揭示了miR-26b和miR-199a在硫化氫調控PGDH表達中的潛在作用。硫化氫能夠抑制這兩種微小RNA的表達，而這兩種微小RNA的模擬物能夠阻斷硫化氫對PGDH表達的上調作用，表明它們可能參與了硫化氫對PGDH表達的調控。

圖1、γ-半胱氨酸合成酶(CSE)和β-半胱氨酸合成酶(CBS)在人胎膜中的定位。A和B：免疫組化分析顯示CSE(A)和CBS(B)陽性染色的代表性切片。C和D：使用一抗得到的陰性對照切片被過量的相應肽預吸收。箭頭表示陽性染色。原始放大倍數，200(A-D)。AE：羊膜上皮；CT：絨毛滋養層；DC：蛻膜。

圖2、足月(TL)、非足月(TNL)和早產(PTL)絨毛組織中γ-半胱氨酸合成酶(CSE)和β-半胱氨酸合成酶(CBS)的表達、硫化氫產生率以及15-羥基前列腺素脫氫酶(PGDH)與CSE或CBS的相關性。絨毛組織取自TNL(24人)、TL(24人)或PTL(21人)時的單胎妊娠婦女。圖2A-C：TNL、TL和PTL絨毛膜組織中CSE(A)、CBS(B)和PGDH(C)的蛋白表達。有代表性的蛋白條帶顯示在相應直方圖的頂部。D：絨毛組織勻漿中硫化氫產生的代表性痕跡。E：TNL、TL和PTL絨毛膜組織的硫化氫產生率。F和G：絨毛組織中PGDH與CSE或CBS的相關性。

圖3、硫化氫對培養的絨毛滋養層細胞中15-羥基前列腺素脫氫酶(PGDH)表達和活性的影響。A-C：NaHS對PGDH mRNA(A)和蛋白(B)表達以及活性(C)的影響。用濃度不斷增加的NaHS(10-5至10-4mol/L)處理細胞24小時。D-F：L-半胱氨酸對絨毛膜細胞中PGDH mRNA(D)、蛋白(E)和活性(F)表達的影響。用濃度不斷增加的L-半胱氨酸(10-4至10-3mol/L)處理細胞24小時。G-I：DL-丙炔基甘氨酸(PAG)和氨基氧乙酸半鹽酸鹽(AOAA)對L-半胱氨酸刺激PGDH mRNA(G)和蛋白(H)表達及活性(I)的影響。在PAG和AOAA存在或不存在的情況下，用L-半胱氨酸(10-3mol/L)處理細胞24小時。J-L：β-半胱氨酸合成酶(CBS)和γ-半胱氨酸合成酶(CSE)在L-半胱氨酸刺激PGDH表達中的作用。用CSE siRNA、CBS siRNA或干擾siRNA轉染細胞，然后用10-3mol/L L-半胱氨酸處理24小時。轉染CSE siRNA(J)和CBS siRNA(K)的細胞中CBS和CSE的代表性表達。L-半胱氨酸對轉染CSE siRNA和CBS siRNA細胞中PGDH表達的影響(L)。PGDH mRNA和蛋白的表達及活性分別通過實時RT-PCR、Western印跡分析和轉化檢測進行測定。

圖4、miR-26b和miR-199a參與硫化氫對絨毛膜中15羥基前列腺素脫氫酶(PGDH)表達的調控以及miR-26b和miR-199a的表達。A和B：含有PGDH 3’-非翻譯區(UTR)及其3’-UTR突變核苷酸的報告基因的熒光素酶檢測。在沒有或有miR-26a、miR-26b和miR-199b模擬物的情況下，用上述報告物轉染絨毛滋養細胞。使用雙熒光素酶報告檢測系統測量細胞裂解物中的熒光素酶活性。C：miR-26b和miR-199a抑制劑及模擬物對PGDH表達的影響。用miR-26b和miR-199a抑制劑及模擬物處理絨毛滋養細胞24小時。D和E：硫化氫對miR-199a和miR-26b表達的影響。用L-半胱氨酸和NaHS處理細胞24小時。實時RT-PCR檢測miR-199a(D)和miR-26(E)的水平。F和G：miR-26b和miR-199a模擬物對硫化氫調控PGDH表達的影響。在沒有或有miR-26b(F)和miR-199a(G)模擬物的情況下，用L-半胱氨酸和NaHS處理細胞24小時。通過Western印跡分析測定PGDH蛋白表達。

結論與展望

絨毛膜NAD依賴性15-羥基前列腺素脫氫酶(PGDH)在控制子宮內前列腺素的數量方面起著關鍵作用，并與分娩過程有關。之前的研究在胎膜中發現了產生硫化氫的β-半胱氨酸合成酶(CBS)和γ-半胱氨酸合成酶(CSE)。本輪的研究人員研究了硫化氫是否參與了分娩過程中絨毛膜中PGDH表達的調節。絨毛組織取自早產、足月或未足月的孕婦。與未足月組相比，足月組和早產兒組的CSE和CBS水平以及硫化氫產生率均呈下調趨勢。CBS水平與絨毛膜中PGDH的表達相關。硫化氫供體NaHS和前體L-半胱氨酸劑量依賴性地刺激了培養的絨毛滋養細胞中PGDH的表達和活性。CBS抑制劑和CBS siRNA可阻斷L-半胱氨酸的作用，而CSE抑制劑和CSE siRNA則不能。硫化氫處理抑制了絨毛滋養細胞中miR-26b和miR199a的表達，miR-26b和miR-199a模擬物阻斷了硫化氫對PGDH表達的上調。研究結果表明，硫化氫在人類妊娠期間維持絨毛膜中PGDH的表達中起著關鍵作用。硫化氫生成酶表達的減少導致了分娩時子宮中前列腺素含量的增加。本研究中Unisense微呼吸系統被用來實時測量蛻膜組織樣本中硫化氫的產生速率。幫助研究者能夠準確地測定蛻膜組織中硫化氫的產生情況，并進一步分析硫化氫生成酶在分娩過程中的作用，特別是在足月和早產期間對PGDH表達的影響。研究者們認為硫化氫生成酶的表達降低可能是導致分娩期間子宮內前列腺素水平增加的原因之一，這可能與早產的發生有關。因此，硫化氫生成酶的活性和其對PGDH表達的調控可能成為預防早產的潛在治療靶點。這項研究不僅為理解硫化氫在分娩過程中的作用提供了新的視角，而且為未來的妊娠相關疾病的治療提供了可能的新策略。