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凍害是造成巨大農業損失和植物死亡的主要因素，研究冷凍脅迫對植物的影響，對于揭示凍害機理，尋找抗凍害途徑，減少因低溫和凍害造成的農作物損失具有重要意義。目前，有關冷凍脅迫的研究主要集中在抗寒基因和基因表達產物、抗氧化防御系統、離子濃度變化和離子流、滲透調節物質等方面。研究表明，冷害會影響水稻細胞中抗氧化活性酶的活性，生成活性氧。]對鷹嘴豆苗進行冷凍處理，發現不飽和脂肪酸比率有所增加，CaCAT和CaSOD基因的轉錄水平升高，并生成大量的防御酶。對水稻進行低溫處理后檢測其根部細胞的鈣離子(Ca2+)流，發現胞外的Ca2+會快速流入細胞內，COLD1基因超表達，水稻細胞對Ca2+的吸收極其強烈，表明COLD1可通過調控Ca2+來激活水稻的抗寒響應。
植物細胞中的Ca2+在抗逆境信號轉導中一直備受人們關注。當細胞受低溫、高溫和鹽堿等外部刺激時，早期的細胞信號事件幾乎都是Ca2+的變化，影響了細胞內Ca2+水平平衡，形成鈣信號被相應細胞器識別。現已有大量冷凍脅迫的研究數據證明，植物細胞內的Ca2+在感應、傳導抗寒信號和誘導生理響應過程中起著重要的作用。當植物受冷凍脅迫時，Ca2+會流進植物細胞內，引起細胞內部Ca2+濃度升高，誘導植物細胞內抗寒基因的表達。Zheng等使用化學定位法研究了冷凍脅迫下枇杷葉肉細胞Ca2+分布的變化，發現冷凍脅迫首先會誘導Ca2+進入細胞內，并在葉綠體膜上聚集，最終進入葉綠體。van der Luit等對低溫脅迫下的煙草幼苗進行了研究，發現低溫會使細胞質和細胞核中Ca2+濃度快速升高，誘導NpCaM-1的表達。Mori等在擬南芥中發現低溫會觸發細胞內游離Ca2+濃度的迅速升高。目前的這些研究大多是檢測組織、細胞或細胞器中Ca2+的分布、濃度變化和離子流來研究植物在受冷凍脅迫時的抗逆反應。但通過檢測冷凍脅迫下原生質體破裂產生的Ca2+濃度信號來分析其細胞液中Ca2+分布的研究仍比較少。
在眾多離子中，鈉離子(Na+)的主要生理作用是增加細胞的滲透勢。當植物吸收大量的Na+后，其胞內的電解質濃度增加，組成原生質體的膠體會發生膨脹，從而提高了原生質的親水性，增加了細胞的保水力。低濃度的Na+對小麥、玉米、大豆、棉花和藻類等植物的生長都有促進作用。在1979年，Brownell和Crossland就已經證實，Na是C4植物的必需營養物質，如鹽生植物濱藜和白刺，Na元素的缺失會導致葉片枯黃，生長延緩。而高濃度的Na+很容易對植物造成毒害，破壞細胞膜和使一些蛋白質不穩定，影響細胞的生理活動，如細胞分裂和生長、代謝及礦質營養元素的動態平衡等方面，抑制植物生長發育。目前對Na+的研究主要集中在植物鹽害和抗鹽性方面，但對冷凍脅迫下植物細胞中Na+分布的相關研究比較少。
近幾年來，由于納米技術的發展，納米材料逐漸以各種方式滲透到人們的生產生活中。氧化鋅納米粒子(ZnO NPs)由于其獨特的物理、化學特性被應用到陶瓷、紡織、醫藥、防曬化妝品和太陽能電池等方面。ZnO NPs可以通過水、土壤和空氣等方式對人類、動物和植物造成影響。當前，有關ZnO NPs對動植物產生負面影響的報道比較多。如陳澤林等發現ZnO NPs對處于吸脹階段、萌動階段和發芽階段的小麥都有毒性作用。Boonyanitipong等的研究表明，ZnO NPs可以阻礙水稻根生長，并減少根的數量。但還有研究表明，ZnO NPs在一定條件下，對植物的生長發育具有積極作用。Prasad等使用粒徑為25 nm、濃度為1 000 mg·L-1的ZnO NPs處理花生種子，發現花生幼苗的萌芽和生存能力都得到了顯著的提升。Pavani等報道稱，ZnO NPs增加了鷹嘴豆新鮮和干燥的重量，促進了其芽、根的伸長。Abdel Latef等研究發現，ZnO NPs還可以減輕其他類型的非生物脅迫對植物所造成的影響。使用粒徑為21.3 nm的不同濃度ZnO NPs(20、40和60 mg·L-1)澆灌鹽漬土栽培(150 mmol·L-1NaCl)的羽扇豆，發現ZnO NPs不但促進了光合色素、酚類化合物和抗壞血酸的形成，還增強了超氧化物歧化酶、氧化氫酶和氧化物酶的活性。與未經ZnO NPs處理鹽漬土栽培的羽扇豆相比，鹽漬土抑制可其生長，減少葉綠素的色素沉淀，削弱過氧化氫酶的活性。但對于植物冷凍脅迫的研究，目前尚未有研究涉及ZnO NPs在植物受冷凍脅迫中的作用。
使用離子選擇性微電極檢測蘆薈(Aloevera)原生質體破裂時形成的Ca2+濃度脈沖，同時檢測Na+濃度作為對比，研究了冷凍脅迫對原生質體中Ca2+的分布的影響。并研究了冷凍溫度、解凍時間和ZnO NPs處理等因素對冷凍脅迫下蘆薈原生質體中離子的分布的影響。
1、材料與方法(Materials and methods)
1.1蘆薈(Aloe vera)細胞原生質體的制備
使用分析天平(XS205DU，精度十萬分之一，Switzerland)稱取2.186 g甘露醇(≥80.5%，中國惠世生化試劑有限公司)、0.222 g二水合氯化鈣(≥98%，西隴化工有限公司)、0.040 g磷酸二氫鉀(≥99.5%，北京化工廠)、0.400 g纖維素酶(U·g-1>15 000，國藥集團化學試劑有限公司)和0.280 g果膠酶(1.18 U·mg-1，Sigma Aldrich)放入燒杯中，加入20 mL去離子水，用磁力攪拌器(CL-2，鞏義市予華儀器有限公司)攪拌。再將得到的溶液進行離心(DT5-6，北京現代北利離心機有限公司)，轉速2 000 r·min-1，時間8 min。取其上清液倒入燒杯中，酶解液制備完成。取長勢優良的蘆薈葉片，用去離子水洗凈，把表面水分吸干，切成3 cm的小段，去除葉片表面透明表皮和中間透明膠質層后，切成4 mm寬的小條。取4 g左右的葉片，放入盛有20 mL酶解液的燒杯中，用封口膜將燒杯口封住。放入恒溫培養振蕩器(ZWYR-240，上海智誠分析儀器制造有限公司)中，黑暗條件下進行酶解，溫度為20℃，轉速為60 r·min-1，時間4 h左右。為促進酶解，每隔1 h搖瓶一次。
酶解后得到含有原生質體、維管成分和未酶解完全的葉子殘片等的混合液，用200目的網篩過濾，得到初步純化的蘆薈原生質體，靜止放置。為減少酶解液中含有的離子對后續測量的干擾，在測量前需用無鈣、無鈉培養基(濃度為109.3 mg·L-1的甘露醇溶液)清洗原生質體。用膠頭滴管吸除原生質體上層的酶解液，向其加入20 mL無鈣、無鈉培養基，靜置20 min。如此反復清洗4次，加入20 mL無鈣、無鈉培養基，室溫下靜止放置，備用。
1.2離子選擇微電極的制備及表征
1.2.1離子微電極的制備
使用微電極拉制儀(WD-2，成都儀器廠)拉制玻璃微電極，設置加熱指數為300，硼硅酸鹽玻璃管(B150-110-10，外徑1.5 mm，內徑1.10 mm，長度10 cm，Sutter Instrument)經電阻圈加熱軟化，重錘下拉，得到微電極管。先將微電極管放置在溫度為200℃的干燥箱中(DHG-9140A，鞏義市予華儀器有限公司)，進行預干燥處理1 h。再采取尾端注入法對微電極管進行硅烷化。然后在微電極管中灌充濃度為10-1mg·L-1的CaCl2或NaCl電解液，并在微電極尖端吸入液體離子交換劑。最后插入Ag/AgCl絲作為內參比電極，鈣或鈉離子選擇性微電極制備完成。
1.2.2離子選擇性微電極的表征
離子選擇性微電極在使用之前需對其進行性能檢測，從線性范圍、檢測下限、響應時間和穩定性4個方面對所制備的Ca2+、Na+選擇性微電極進行了表征，如圖1所示。
由圖1(a)、(b)中可知，Ca2+、Na+選擇性微電極在標定液濃度10-1～10-5mol·L-1范圍內都有良好的響應，回歸系數分別為0.9991、0.9996，檢測下限均可達10-5mol·L-1。圖1(c)為微電極在10-3mol·L-1的標定液中，連續檢測3 h內的電位值，平均電位值分別為-(14.46±0.24)、-(52.44±0.59)mV，穩定性都良好。圖1(d)為Ca2+、Na+選擇性微電極在不同濃度標定液中的響應時間，分別為(0.550±0.016)、(0.646±0.014)s，都小于1 s，響應性能良好。以上情況說明，制得的Ca2+、Na+選擇性微電極具有良好的性能，滿足實驗的要求。
1.3 ZnO NPs的表征及懸浮液的配制
1.3.1 ZnO NPs的表征
圖2(a)、(b)分別為ZnO NPs(Sigma Aldrich)的XRD譜和TEM圖。在圖2(a)中，經與PDF#36-1415卡片對照后，發現測試譜中的所有衍射峰與標準譜完全一致，說明該物質為六角纖鋅礦型ZnO，未見其他雜相存在。由圖2(b)可以看出ZnO NPs形狀呈球形，形貌均勻，平均直徑約為20 nm。
1.3.2 ZnO NPs懸浮液的配制
用分析天平稱取0.60、1.00、1.40和1.80 mg的ZnO NP放入燒杯中，分別加入20 mL無鈣、無鈉培養基。水浴超聲(KQ-250DB，350 W，昆山市超聲儀器有限公司)10 min，配制成濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1的ZnO NP懸浮液。
1.4蘆薈原生質體的冷凍處理
用膠頭滴管吸除原生質體層上的培養基，搖晃燒杯，用移液槍吸取原生質體向6只培養管中各滴入1 000μL，注入5 mL的無鈣、無鈉培養基。其中1只室溫下保存，5只放入冰箱冷凍處理，使其溫度分別降至10℃、0℃、-5℃、-7℃和-10℃，取出后室溫下靜止放置，使已結冰的培養基完全解凍，溫度恢復到室溫待用。
1.5用ZnO NPs進行預處理和后處理
預處理：將蘆薈原生質體隨機分成約等量的4組，每組4份。取其中一組，分別注入5 mL不同濃度的ZnO NPs懸浮液(30、50、70和90 mg·L-1)，放入冰箱冷凍處理，待溫度降至-7℃后取出解凍，使其溫度恢復到室溫。
后處理：再取一組，分別滴入裝有5 mL的無鈣、無鈉培基的培養管中，放入冰箱中冷凍結冰后取出。靜止放置，待其溫度恢復到室溫時，去除上層培養基，注入不同濃度的ZnO NPs懸浮液(30、50、70和90 mg·L-1)各5 mL，處理20 min。
最后取剩余2組，分別加入5 mL的不同濃度ZnO NPs懸浮液，靜止室溫下分別處理3和18 h。
1.6離子脈沖信號的檢測
為降低實驗環境中可能存在的震動和電磁輻射對測量信號的干擾，實驗需在金屬屏蔽網中的防震臺上進行。先將Ca2+、Na+選擇性微電極和作為參比的甘汞電極分別固定在三維微操縱儀上，并與微電極放大器(SWF-1D，成都儀器廠)的前級相連(Ca2+、Na+選擇性微電極分別接到不同的輸入通道)。將樣品池(10 mL無菌培養皿)放在倒置顯微鏡(CPX41，Olympus)的操作臺上，將甘汞電極移到距樣品池底部約0.5 cm處，緩慢將Ca2+、Na+選擇性微電極靠近樣品池底部并固定。將倒置顯微鏡調至4倍物鏡，調節三維操縱儀使得2支選擇性微電極在視野中央。再將物鏡切換到10倍，細調三維微操縱儀使Ca2+、Na+選擇性微下降至樣品池底部，需保持2只微電極的尖端同時在視野中。最后用移液槍吸取50μL的待測原生質體，滴入裝有10 mL低滲液(濃度為0.0273 mg·L-1的甘露醇溶液)的培養管中，輕輕搖晃均勻后緩慢倒入樣品池中。保證甘汞電極和Ca2+、Na+選擇性微電極同時浸沒在溶液中。通過顯微鏡在視野中找到一個原生質體作為待測目標，并且視野中應沒有其他原生質體存在。將Ca2+、Na+選擇性微電極分別移動到目標原生質體附近，使2支選擇性微電極的尖端盡量靠近該原生質體的同一位置。關閉屏蔽網，生理信號采集系統(RM6240B，成都儀器廠)開始記錄并將信號顯示在顯示器上。觀測到原生質體破裂的脈沖信號后，再等待電位恢復平穩停止記錄，保存數據。
1.7統計學方法
每組實驗重復3次，每次實驗中從每組原生質體中隨機選取3個原生質體(合計每組9個原生質體)進行離子濃度脈沖測試，用SPSS 22.0軟件(SSPS Inc.)對實驗數據進行方差分析。采用ANOVA方法對實驗數據進行差異顯著性分析(檢驗標準為P<0.05)。*表示P<0.05，**表示P<0.01。實驗數據表述為平均值±標準偏差。
