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2結果與分析
2.1冷凍對原生質體中Ca2+、Na+分布的影響
圖 3 未經冷凍處理(a)與經冷凍處理(b)的蘆薈原生質體破裂時形成的 Ca2+、Na+脈沖信號
未經冷凍和經冷凍處理的蘆薈原生質體破裂時的Ca2+、Na+脈沖信號(以電極電位表示，下同)如圖3所示。由圖3(a)可知，未經冷凍處理的Ca2+、Na+信號在原生質體破裂前電位相對平穩，對應背景離子濃度。當原生質體開始破裂時，其周圍的Ca2+濃度明顯上升，直至離子濃度達到一個峰值，這段時間為T1，計算得到T1=(11.5±2.2)s。之后隨著Ca2+慢慢向周圍擴散，Ca2+濃度慢慢開始下降，直至趨于平穩，回復到背景濃度。整個過程結束后形成了一個向上的脈沖信號。這個脈沖信號為一個單一的脈沖，沒有疊加其他細節，表明原生質體內Ca2+濃度分布比較均勻。Na+濃度脈沖信號與此類似，原生質體開始破裂到達到峰值所用時間為t1，計算得到t1=(4.0±0.98)s。圖3(b)為經冷凍處理的原生質體破裂時產生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。與圖3(a)對比發現，經冷凍處理后，Ca2+的脈沖信號發生了明顯變化。雖然在破裂前Ca2+的濃度仍保持在背景濃度上，但當原生質體開始破裂時，經冷凍處理后的原生質體周圍的Ca2+濃度并未像未經冷凍處理的原生質體那樣快速上升，反而先顯著地下降達到一個最低點，緊接著才迅速上升，在Ca2+濃度脈沖的前沿處形成一個明顯的“凹陷”，從原生質體破裂到凹陷恢復所用時間為T2，經計算得到T2=(11.3±1.5)s，形成凹陷的深度為H，計算得H=(16.9±2.4)mV，從原生質體破裂到脈沖最高點所用時間T1’=(19.8±3.0)s。而經冷凍處理的原生質體的Na+的濃度脈沖信號則與未經處理的原生質體破裂時的離子信號情況基本相同，沒有出現前沿凹陷的現象，t1’=(3.9±1.0)s。經對比發現，經冷凍處理后的Ca2+濃度脈沖從原生質體破裂開始至到達峰值所有的時間T1大于未經冷凍處理的Ca2+濃度脈沖的相應值，兩者間存在顯著差異(P<0.01)，相差約8 s；而Na+濃度脈沖在冷凍前后t1幾乎沒有變化(二者無統計學差異，P>0.05)。
經冷凍處理后的蘆薈原生質體，其破裂時形成Ca2+濃度脈沖信號前沿出現顯著的凹陷現象，說明原生質體中的Ca2+分布不再均勻，靠近細胞中心濃度較高，而細胞膜附近濃度較低，產生了分層現象。
原生質體在低滲液吸水而膨脹破裂的。由于在這一過程中有水滲透進原生質體，如果原生質體內的Ca2+不能很快擴散進這些新滲入的水中，則在原生質體中靠近細胞膜處便會形成一個Ca2+的低濃度區，這自然會使脈沖信號的前沿處出現一個與低濃度區相對應的凹陷。
但從圖3(a)中可知，未經冷凍處理蘆薈原生質體在破裂時，其Ca2+濃度脈沖的前沿處并未出現這種凹陷。這說明，未經冷凍處理的蘆薈原生質體內的Ca2+能夠很快地擴散到滲入原生質體內的水中，維持了Ca2+濃度的均勻分布。這也表明，未經冷凍處理的原生質體對其內部的Ca2+濃度分布具有很好的調控能力。
經過冷凍后的蘆薈原生質體在破裂時其Ca2+濃度脈沖信號前沿處出現了凹陷，表明其中的Ca2+流動性變差，或者說原生質體調控Ca2+濃度分布的能力遭到了破壞，使得Ca2+不能很快擴散到滲入的水中去，造成Ca2+濃度分布不均勻，出現了分層現象。
以往人們在研究低溫脅迫或細胞的冷凍保存與復蘇時，大多集中于研究胞外空間的離子流變化或水結冰時形成的冰晶對細胞的機械損傷，而沒有注意到細胞調控Ca2+分布的能力的變化。趙明明等研究了低溫處理后冬青葉片細胞內Ca2+水平變化，結果表明，細胞內Ca2+沉淀隨溫度的降低而有所增加。楊蕊等報道了在4℃下黃楊葉肉細胞中Ca2+和Ca2+-ATPase的變化，處理3～12 h后細胞間隙和液泡中的Ca2+沉淀顆粒較少，而細胞質和細胞核內的Ca2+增多，Ca2+-ATPase分布幾乎未受影響，處理24 h后，細胞質和細胞核內Ca2+開始轉移到細胞間隙和液泡中，Ca2+-ATPase的活性增強。在2018年，雖然Mori等在文章中提到低溫會引起擬南芥細胞內Ca2+濃度的迅速升高。但這些研究均未提及Ca2+的濃度分布是否出現分層現象。因此，筆者的研究結果對于今后這方面的研究具有一定的借鑒意義。與Ca2+不同，Na+在冷凍處理后其濃度分布沒有發生分層的現象，這可能與細胞對Ca2+和Na+分布的調控機制不同，及Ca2+和Na+在細胞抗冷凍反應中的作用有關，需要作進一步的深入研究。
2.2冷凍溫度對蘆薈原生質體中Ca2+、Na+分布的影響
為了進一步研究冷凍溫度對蘆薈原生質體中Ca2+、Na+濃度分布的影響，將蘆薈原生質體冷凍至不同溫度后，研究了其中的Ca2+、Na+濃度分布。
圖4為冷凍至不同溫度的蘆薈原生質體，在低滲液中破裂時的產生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。(a)～(f)的溫度分別為18℃、10℃、0℃、-5℃、-7℃和-10℃。從圖中可以看出，當溫度為18℃、10℃、0℃和-5℃時Ca2+、Na+的信號脈沖與未經冷凍處理的原生質體破裂時的離子信號基本相同，其信號前沿處均未出現凹陷。而當冷凍至-7℃時，Ca2+脈沖的前沿部分開始出現明顯的“凹陷”，原生質體中Ca2+分布發生了改變。溫度降低到-10℃時，凹陷依然存在。
使用焦銻酸鈣沉淀的電鏡細胞化學方法研究水稻幼苗細胞經1℃處理24、48 h后細胞中Ca2+定位分布的變化。研究發現，處理24 h胞質膜內側形成了一圈Ca2+沉淀顆粒，當處理時間增加到48 h后，液泡中的Ca2+許多也分布在液泡膜的內側，一部分顆粒趨向靠近液泡膜，而液泡中心部分的Ca2+分布似乎有減少的趨勢。謝潮添等同樣使用焦銻酸鈣沉淀的電鏡細胞化學方法，研究了2℃下的董棕幼苗葉肉細胞中Ca2+水平及其細胞超微結構的變化，研究表明，未經低溫處理的董棕幼苗葉肉細胞，焦銻酸鈣沉淀顆粒大量出現在液泡和細胞間隙中。48 h低溫處理后，細胞基質和細胞膜上焦銻酸鈣沉淀增加，葉綠體外膜受損。處理120 h后，焦銻酸鈣沉淀大多分布在胞基質和細胞膜上，較少分布在液泡和核基質中。葉綠體、核膜和液泡膜嚴重破損，內部結構模糊。上述研究表明，低溫處理有使Ca2+向細胞膜附近聚集的趨勢，這與筆者的發現似乎剛好相反。不過，上述研究均使用了焦銻酸鈣沉淀的電鏡細胞化學方法，測量過程中細胞中的Ca2+以沉淀方式被析出，而且透射電鏡觀察需要對細胞進行固定，這些都影響了的Ca2+的流動性。而筆者所采用的方法則不需要對Ca2+進行沉淀析出，也不用對細胞進行固定處理，所得的結果應當更接近細胞內Ca2+的真實分布。
圖4不同冷凍溫度下原生質體破裂時的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(f)溫度分別為18℃、10℃、0℃、-5℃、-7℃和-10℃。
有趣的是，在各種不同的溫度下，Na+脈沖信號的前沿始終沒有出現凹陷。這說明，冷凍脅迫會對蘆薈原生質體中的Ca2+分布造成影響，但對Na+分布幾乎沒有影響。
2.3解凍時間對冷凍處理后Ca2+分布的影響
為了研究解凍時間對冷凍處理后Ca2+分布的影響，筆者選擇冷凍至-7℃的蘆薈原生質體為研究對象。將其解凍不同時間后，對其Ca2+濃度分布進行測量。圖5為蘆薈原生質體解凍后1、3和5 h后，其破裂時產生的Ca2+脈沖信號的情況。可以觀察到經冷凍處理后的原生質體的Ca2+濃度脈沖前沿處的“凹陷”現象在解凍5 h后依然沒有消失，原生質體中的Ca2+濃度分層的現象依然存在。這說明，冷凍造成的原生質體內Ca2+流動的降低，或者說原生質體對Ca2+濃度的調控能力的下降，并不會在原生質體解凍后馬上恢復，而是會持續相當長的時間。
2.4 ZnO NPs預處理對冷凍原生質體中Ca2+、Na+分布的影響
圖6為經不同濃度ZnO NPs預處理后再進行冷凍(溫度降至-7℃)的蘆薈原生質體，在低滲液中破裂時產生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。圖中(a)～(d)的ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
由圖6可知，不同濃度ZnO NPs預處理后原生質體破裂時的Ca2+濃度脈沖曲線在前沿處也都出現了“凹陷”現象。但與未經ZnO NPs預處理的情況相比，經處ZnO NPs理后Ca2+濃度脈沖前沿處的凹陷程度都明顯減小，凹陷深度H為(1.5±0.78)mV。明顯小于冷凍脅迫下未加ZnO NPs的凹陷深度(16.9±2.4)mV，相差約為15.4 mV，統計分析表明二者存在顯著差異(P<0.01)。這說明，二者中的Ca2+濃度分布情況有明顯差異，Ca2+濃度分布發生變化。雖然大量研究都已表明，ZnO NPs對植物細胞具毒性，如破壞膜的完整性，DNA鏈斷裂，抑制葉綠素的形成等。但至少從筆者的研究結果來看，ZnO NPs預處理對抵抗冷凍所造成的Ca2+流動性下降，維持細胞對Ca2+濃度分布的調控能力方面具有一定的積極作用。與前面的情形一樣，Na+濃度脈沖的形狀仍沒有明顯的變化，沒有出現前沿凹陷在現象。
圖5解凍后1 h(a)、3 h(b)和5 h(c)后蘆薈原生質體破裂時產生的Ca2+脈沖信號
圖6不同濃度ZnO NPs預處理后冷凍脅迫下原生質體破裂時的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
2.5 ZnO NPs對冷凍后原生質體中Ca2+、Na+分布的影響
圖7為蘆薈原生質體先經冷凍處理(溫度降至-7℃)后，再用不同濃度的ZnO NPs進行后處理，最后將其放入低滲液中所測得的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。
圖7 ZnO NPs處理解凍后原生質體破裂后Ca2+、Na+信號脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
由圖中可以看出一個十分有趣的現象。解凍后再經不同濃度ZnO NPs處理的原生質體在低滲液中破裂時，不但Na+濃度脈沖的前沿處沒有出現凹陷，Ca2+濃度脈沖前沿處的“凹陷”也消失了。這說明，ZnO NPs處理使得蘆薈原生質體中由于冷凍造成的Ca2+濃度分層消失了，ZnO NPs的加入使得Ca2+濃度分布又發生了新的變化，造成這一現象的具體原因目前還不是十分清楚。
2.6 ZnO NPs對未經冷凍的蘆薈原生質體中Ca2+、Na+分布的影響
為了進一步探究冷凍前后ZnO NPs處理可使濃度脈沖前沿凹陷深度減小甚至消失這一問題，了解原生質體內部Ca2+、Na+濃度分布的變化情況。筆者檢測了不同濃度ZnO NPs處理3和18 h的未經冷凍的蘆薈原生質體破裂過程中產生的Ca2+、Na+濃度脈沖情況，檢測結果如圖8和圖9所示。
由圖8可知，當ZnO NPs濃度為30、50和70 mg·L-1時，經3 h處理后，蘆薈原生質體破裂時產生的Ca2+、Na+信號中均未出現前沿凹陷的現象。而當ZnO NPs濃度為90 mg·L-1時，發現Ca2+濃度脈沖的前沿有輕微的凹陷。另一個值得注意的現象是，圖8(b)～(d)中，在脈沖上升段的開始處，其上升趨勢更加陡峭。而且，隨著處理時間的增加，這種趨勢更加明顯，如圖9所示。
從圖9中可以明顯看出，(a)～(d)中4組脈沖信號的上升段的開始處，脈沖上升速度極快，與其后部分的上升速度有明顯區別。筆者統計了未經ZnO NPs處理、經ZnO NPs分別處理3和18 h的Ca2+濃度脈沖上升部分時間T1和該部分前1/3處時間T1/3，如圖10所示。
經過比較發現，未經ZnO NPs處理與ZnO NPs處理的Ca2+濃度脈沖其從原生質體破裂到達到最大值所用的時間T1基本一致，而在上升的前1/3處所用的時間T1/3相差明顯。
這一明顯區別表明，與冷凍造成的原生質體內靠近細胞膜處Ca2+濃度下降不同。經ZnO NPs處理后的蘆薈原生質體中，靠近細胞膜處的很小范圍內，Ca2+濃度有較為明顯的上升趨勢。這說明，Ca2+濃度分布與未經ZnO NPs處理時相比發生了變化，猜想可能是ZnO NPs使得蘆薈原生質體中Ca2+在細胞膜附近分布較集中，從而導致細胞膜破裂后，在脈沖前沿形成較明顯的濃度變化。可能正是這一現象，使得經ZnO NPs預處理的蘆薈原生質體，在冷凍后其Ca2+濃度脈沖前沿處的凹陷變淺；也會使先冷凍再用ZnO NPs進行后處理的蘆薈原生質體的Ca2+濃度脈沖前沿凹陷消失。這當中的具體機制值得深入研究。經過不同時間的ZnO NPs處理，Na+濃度脈沖的形狀依然沒有明顯變化，沒有出現前沿凹陷在現象。
圖8不同濃度的ZnO NPs處理3 h后的蘆薈原生質體破裂時的Ca2+、Na+濃度脈沖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
圖9不同濃度ZnO NPs處理18 h后的原生質體破裂時的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
圖10未處理、ZnO NPs處理3和18 h的Ca2+濃度脈沖上升部分時間T1和T1/3
綜上，使用Ca2+離子選擇性微電極檢測了經冷凍處理后的蘆薈原生質體在低滲液中破裂時產生的Ca2+濃度脈沖信號。研究了冷凍溫度、解凍時間和ZnO NPs處理等因素對蘆薈原生質體中Ca2+分布的影響。發現蘆薈原生質體被冷凍至-7℃以下時，其Ca2+脈沖信號前沿處發生明顯的“凹陷”，Ca2+分布出現分層現象。靠近細胞中心濃度較高而細胞膜附近濃度較低。這說明，冷凍造成蘆薈原生質體中Ca2+的流動性下降，原生質體對Ca2+濃度分布的調控能力降低。這一現象在原生質體解凍5 h后仍未消失。
經過ZnO NPs預處理后再進行冷凍的原生質體，其脈沖凹陷深度明顯減小；而當用ZnO NPs對解凍后的原生質體進行后處理時，Ca2+分層現象消失。這可能是由于ZnO NPs處理使得蘆薈原生質體中Ca2+分布趨近于細胞膜附近導致的。這表明，盡管ZnO NPs對植物細胞具有一定的毒性，但其在防止冷凍造成的Ca2+流動性下降，維持細胞Ca2+分布的調控能力方面，仍然具有一定的積極作用。
