以谷氨酸興奮性毒性為主要特征的神經毒性損傷，與卒中的發生、發展，神經元的壞死和細胞的凋亡都存在密切的聯系，卒中后的再灌注損傷成為目前亟待解決的問題。目前已證實一些神經保護劑可減少谷氨酸的釋放，低溫也可降低谷氨酸的釋放，因此了解缺血后谷氨酸的動態變化有助于認識神經細胞壞死的程度，從而為今后延緩或阻止細胞壞死提供藥物治療的評價依據。卒中后大部分患者經受著不同程度的偏側癱瘓或運動障礙，皮質運動區負責對側半身的隨意運動，卒中引起的對側偏癱表明病灶同側的皮質運動區產生了病理改變，而皮層的損傷程度為判斷預后提供了幫助。CIRSTEA等也通過磁共振波譜證實卒中6個月后病灶同側正常顯影的灰質中的谷氨酸濃度與肢體癱瘓程度呈正相關，因此谷氨酸的變化也有助于卒中后臨床表現進程的研究，從而作為卒中預后指標。

如今，非人靈長類動物作為臨床前研究的重要實驗對象，對于靈長類動物缺血后皮層谷氨酸的動態變化尚少見報道，因此，本研究運用電化學微電極傳感器技術檢測活體食蟹猴腦缺血過程中皮層谷氨酸水平及動態變化，為今后進一步探索腦缺血皮層谷氨酸動態變化與卒中臨床表現的關系提供依據，旨在為谷氨酸成為治療評價及預后判斷的指標奠定理論基礎。

1.材料與方法

1.1研究對象

所用動物來自廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司實驗室(以下簡稱靈康公司)，該實驗室經過國際動物評估認證管理委員會(AAALAC)認證。選取3只正常食蟹猴，編號為NHP1、NHP2、NHP3,NHP1為雄性，6歲，9.5 kg；NHP2為雌性，9歲，4.2 kg；NHP3為雌性，7歲，4.0 kg。本研究在靈康公司靈長類動物實驗室進行，3只動物分別放置在標準單籠(深×寬×高為60 cm×77 cm×75 cm)內飼養，動物房溫度22~28℃，相對濕度為30%~75%，12 h/12 h明暗交替，每日早晚兩次喂食標準飼料(碳水化合物0.492 g/g，蛋白質0.237 g/g，脂肪0.061 g/g)，中午給予1次新鮮蔬菜或水果，動物不限制進水。本研究方案已遞交靈康動物倫理委員會(IACUC)審核并獲得批準。

1.2方法

1.2.1主要儀器

FAST-mkⅢ神經遞質實時檢測系統(美國Quanteon公司)，谷氨酸檢測電極來自美國肯塔基大學微電極技術中心。

1.2.2缺血性腦卒中模型的建立和谷氨酸實時動態檢測

實驗食蟹猴術前禁食16 h，常規麻醉，舒眠寧(0.03 mL/kg)、阿托品(0.04 mg/kg)肌注，術中持續異氟烷(1%~3%)吸入麻醉。頭部備皮，常規消毒鋪巾。將左側顴弓上緣水平線與眶外緣垂直線連線交點，和顱骨矢狀線與雙外耳道連線(顱骨映射線)交點，兩交點連線即為左側大腦中動脈大致走行方向，沿該連線做一長切口，依次進入皮膚、皮下組織、筋膜、顳肌，翻開并去掉部分顳肌，暴露顱骨，以左側顴弓上緣上側與眶外緣后側為邊界做一約20 mm×15 mm顱骨開窗(骨窗一)；在同側皮層運動區做一約15 mm×10 mm顱骨開窗(骨窗二)。在骨窗一，沿大腦外側裂經腦棉保護向內游離暴露大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)M1段，將MCA M1近端夾閉1 h后放開。在骨窗二，將谷氨酸檢測電極固定于立體定向支架上，并連接FAST-16mkⅢ神經遞質實時檢測系統，獲取夾閉前1 h、夾閉時1 h及夾閉放開后1 h該部位谷氨酸的持續變化，這3個時間窗內谷氨酸檢測為連續性的，均在1次手術中完成。檢測完畢，縫合骨窗一骨瓣，骨蠟密封，保留骨窗二，關顱縫皮。在術后第1周和第2周經骨窗二進行谷氨酸實時動態檢測1 h，手術準備與操作同前，谷氨酸檢測方法已有應用。

1.2.3谷氨酸電化學檢測

谷氨酸電化學檢測主要分為校準和檢測。每次實驗檢測前對所用電極進行檢測物(谷氨酸)、干擾物(抗壞血酸)、可能影響物(如過氧化氫、多巴胺等)比對校準，獲取電極檢測限、靈敏度、特異性、濃度線性擬合(R2)等參數，本實驗校準參數如下(n=9)：檢測限為(1.18±0.88)μmol/L，靈敏度為(5.3±4.4)pA/(μmol·L)，谷氨酸特異性(谷氨酸氧化反應電流/抗壞血酸還原反應電流)為(9.7±5.7)：1，R2為(0.993 1±0.010 0)。校準后將檢測電極與FAST-16mkⅢ系統連接置于檢測部位，便可用于檢測。

1.2.4谷氨酸檢測位點

選取手術同側皮層運動區的腦回,檢測深度位于腦表面下3 mm，選取的位點已在類似研究中應用，具體為耳棒：15.0~20.0 mm，中線：10.0~11.0 mm。該區域為大腦中動脈供血區，支配上肢運動區域。

2.結果

圖1食蟹猴在夾閉MCA M1的術前、術后第1周和術后第2周的T2WI及MRA影像學表現

腦缺血過程中的谷氨酸變化

谷氨酸采集頻率為4 Hz，每個檢測窗各選取3段30 s檢測濃度進行分析，每段之間相隔10~20 min，所得數據由每段檢測濃度的平均值獲得。皮層運動區谷氨酸濃度：3只食蟹猴術前基礎濃度(7.7±6.1)μmol/L，夾閉MCA M1(37.8±25.2)μmol/L，夾閉放開(38.3±25.1)μmol/L；術后第1周(12.2±9.5)μmol/L；術后第2周(23.7±26.1)μmol/L。在夾閉MCA M1時或夾閉放開后較基礎濃度升高(t=4.200，P=0.003；t=4.25，P=0.003)，夾閉放開后較夾閉MCA M1時谷氨酸濃度變化差異無統計學意義(t=0.160，P=0.877)，術后第1周較夾閉MCA M1時或夾閉放開后谷氨酸濃度明顯下降(t=3.95，P=0.004；t=4.320，P=0.003)，術后第2周較術后第1周谷氨酸濃度變化差異無統計學意義(t=1.970，P=0.085)。

圖2食蟹猴在夾閉MCA M1后2周內神經功能缺損評分的變化

3.結論

本研究使用的FAST-mkⅢ系統，檢測頻率為1~1 000 Hz，檢測電極尖端寬度150μm。相對于微透析技術，FAST具有創傷性更小、檢測頻率更高、即時記錄等特點，可以檢測亞秒級的谷氨酸瞬時變化并即時記錄，幾乎不存在時間延遲效應，能夠非常精確地反映腦內神經遞質的瞬時變化水平。本研究中各檢測窗還未發現谷氨酸濃度驟然的起伏，只是在夾閉MCA M1后出現過緩慢的持續上升過程。目前的不足之處在于，利用FAST系統進行缺血食蟹猴清醒狀態下長期在體檢測的技術難題仍未解決。

總而言之，本研究活體檢測食蟹猴缺血過程中皮層谷氨酸的動態變化，或許能夠為卒中進展過程中臨床表現的變化提供評價依據，為谷氨酸成為卒中治療和判斷預后的指標提供可能。