研究簡介:隨著全球人口老齡化的增加，與年齡相關(guān)的骨缺陷問題，如骨質(zhì)疏松和骨折愈合緩慢，已成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。這些問題主要是由于骨組織再生能力的下降和微環(huán)境的惡化。在衰老的干細(xì)胞中，活性氧（ROS）的過度積累是細(xì)胞衰老的一個(gè)關(guān)鍵特征，它會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，損害蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等細(xì)胞組分，從而阻礙老化骨骼的修復(fù)。為了解決這一問題，研究者們開發(fā)了一種創(chuàng)新的多層次ROS清除系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過一種可注射的水凝膠實(shí)現(xiàn)，該水凝膠由PEG化聚甘油月桂酸酯（PEGS-NH2）和聚(γ-谷氨酸)（γ-PGA）組成，并含有載有雷帕霉素的聚（二硒代碳酸酯）納米膠束（PSeR）。這種水凝膠設(shè)計(jì)用于響應(yīng)老化微環(huán)境中的ROS水平，并具有高度敏感性，能夠動態(tài)釋放藥物以清除衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）中積累的細(xì)胞內(nèi)ROS。研究顯示，PSeR水凝膠能夠通過保護(hù)DNA復(fù)制過程中的氧化環(huán)境，有效調(diào)節(jié)骨間充質(zhì)干細(xì)胞的抗氧化功能，并延緩細(xì)胞衰老。這有助于恢復(fù)細(xì)胞的自我更新能力，并增強(qiáng)老化骨骼修復(fù)的成骨能力。在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，PSeR水凝膠都顯示出了促進(jìn)老化骨骼修復(fù)的潛力。此外，該水凝膠的開發(fā)還考慮了對ROS的多層次調(diào)節(jié)，包括減少細(xì)胞內(nèi)外ROS的積累、提高抗氧化能力、通過ROS清除恢復(fù)衰老細(xì)胞的功能，以及適應(yīng)老化骨骼再生的屬性。這些特性使得PSeR水凝膠成為一種有前景的治療手段，不僅能夠促進(jìn)老化骨骼的修復(fù)，還可能為其他退行性疾病的治療提供新的思路。

本研究通過開發(fā)一種新型的ROS響應(yīng)水凝膠，為老化骨骼的修復(fù)提供了一種新的治療方法。這種方法通過調(diào)節(jié)ROS水平，改善了衰老細(xì)胞的微環(huán)境，從而有助于恢復(fù)其再生能力，為應(yīng)對全球老齡化帶來的健康挑戰(zhàn)提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

Unisense微電極測定系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微電極系統(tǒng)被用于測量血清的REDOX電位。REDOX電位是衡量氧化還原狀態(tài)的指標(biāo)，可以反映血清中氧化劑和還原劑之間的平衡。在老化和退行性疾病的研究中，了解血清的REDOX狀態(tài)對于評估細(xì)胞的抗氧化能力和氧化應(yīng)激水平是非常重要的。Unisense微電極系統(tǒng)包含微電極，其尖端直徑為100微米，用于直接測量生物樣品中的REDOX電位。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

開發(fā)了一種新型的多層次活性氧（ROS）調(diào)節(jié)水凝膠，用于恢復(fù)老化骨骼的修復(fù)能力。ROS的過度積累是衰老干細(xì)胞的特征，會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和微環(huán)境惡化，從而阻礙老化骨骼的修復(fù)。設(shè)計(jì)了一種可注射的PEG化聚甘油月桂酸酯（PEGS-NH2）和聚(γ-谷氨酸)（γ-PGA）水凝膠，該水凝膠包含載有雷帕霉素的聚（二硒代碳酸酯）納米膠束（PSeR），用于敏感響應(yīng)局部老化微環(huán)境中的ROS。PSeR水凝膠能夠動態(tài)釋放藥物載載納米膠束，以清除衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）中積累的細(xì)胞內(nèi)ROS，并通過保護(hù)DNA復(fù)制來調(diào)節(jié)抗氧化功能，延緩細(xì)胞衰老。體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了水凝膠增強(qiáng)骨間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新能力和成骨能力的效果。在老年小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，PSeR水凝膠顯著提高了老化骨骼缺陷的修復(fù)效率。

圖1、具有ROS清除能力的SeR納米膠束的制備和表征。a)mPEG-b-P(TMC-co-MSeSe)和SeR納米膠束的合成路線。b)mPEG-b-P(TMC-co-MSeSe)的1 H NMR分析。c)mPEG-b-P(TMC-co-MSeSe)和100μm H 2 O 2氧化的mPEG-b-P(TMC-co-MSeSe)的77 Se NMR分析，氧化后，峰位置從290.23至1300.16 ppm。d)PBS中SeSe納米膠束的代表性透射電子顯微鏡(TEM)圖像，插圖是單個(gè)納米膠束的高強(qiáng)度圖像。比例尺：100 nm。e)使用TMA-DPH作為熒光探針檢測SeSe納米膠束的臨界膠束濃度（CMC）。對應(yīng)于交點(diǎn)的橫坐標(biāo)表示lg CMC。f)通過納米顆粒跟蹤分析儀器（NTA）測量的SeSe納米膠束的尺寸分布。g)SeSe膠束在不同濃度的H 2 O 2反應(yīng)15分鐘后的Rapa釋放率，當(dāng)受到50和100μm的H2O2濃度時(shí)，超過98％的R釋放。h)SeSe膠束在含有不同濃度H2O2的PBS中的形態(tài)和粒徑頻率的TEM圖像。SeSe膠束的大小與H2O2濃度相關(guān)并且在100μmH2O2中破裂。

圖2、負(fù)載SeR納米膠束(PSeR)的可注射PEGS-PGA水凝膠的制備和表征。a)PEGS-PGA通過羧基調(diào)節(jié)衰老微環(huán)境的示意圖。b)PEGS-NH 2的1 H NMR分析。c)均勻分散在PEGS-PGA中的SeSe/FITC膠束的熒光圖像。d)可注射PSe水凝膠的照片，該水凝膠具有對復(fù)雜輪廓的形狀適應(yīng)性和對骨缺損的粘附力。成型時(shí)間小于60秒。e)P和PSe水凝膠在10μm FeSO 4溶液中對Fe 2+的螯合能力。g)P和Pse水凝膠的FT-IR光譜。f)Fe2p3/2和Fe2p1/2峰的XPS譜。h)P和PSe水凝膠對·OH清除的影響。SA與Fe2+和H 2 O 2反應(yīng)用作對照。i)通過510 nm處的特征吸光度測量羥基自由基的相對殘留量。j)Rapa在不同濃度的H2O2下從PSeR水凝膠中的累積釋放曲線。

圖3、PSeR水凝膠調(diào)節(jié)衰老BMSCs的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外ROS水平，并提高衰老BMSCs的體外抗氧化能力。a)微電極監(jiān)測動物血清氧化還原電位。b)HORAC熒光素探針檢測動物血清的抗氧化能力。c)DCFH-DA熒光染色和JC-1熒光染色檢測CM誘導(dǎo)的BMSC。比例尺：200μm。d,e)流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSCs的DCFH-DA熒光強(qiáng)度。f)使用JC-1試劑通過熒光共聚焦和定量分析檢測線粒體膜電位。比例尺：100μm.g,h)Sirt1和Sod2的定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析。i,j)經(jīng)水凝膠處理后BMSC中LC3B蛋白的表達(dá)。i,k)水凝膠處理后BMSC中γH2A.X蛋白的表達(dá)。

圖4、PSeR水凝膠通過體外干預(yù)衰老來改善衰老干細(xì)胞的功能。a)對水凝膠處理3天的BMSC中的p16和p53進(jìn)行qRT-PCR分析。b)水凝膠處理3天的BMSC中SASP因子的qRT-PCR分析。c)BMSC的SA-β-gal染色。比例尺：100μm。d,e)BMSCs與水凝膠在成骨基質(zhì)中共培養(yǎng)14天和21天后的ALP染色和ARS染色。比例尺：100μm。f)第14天的ALP活性量化。g)第21天的ARS活性量化。

圖5、PSeR治療減弱衰老BMSC中年齡相關(guān)通路的表達(dá)。a)維恩圖，顯示Y與S以及S處理與S處理的BMSC的DEG。b)熱圖，代表Y與S處理與S處理的前100個(gè)顯著基因表達(dá)值。c)Y與S顯著差異表達(dá)基因(DEG)的代表性KEGG通路（p≤0.05，|log倍數(shù)變化|≥1）。d)S處理與S處理顯著不同的表達(dá)基因的代表性KEGG通路（p≤0.05，|log倍數(shù)變化|≥1）。e)Y與S以及S處理與S的MSC的GSEA圖（|NES|>1，標(biāo)稱p值<0.05，F(xiàn)DR<0.25）。f)示意圖總結(jié)了S處理與S處理的DEG與G1到S過渡期間細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的DEG，通過KEGG通路聚類進(jìn)行分析。

結(jié)論與展望

衰老引起的活性氧（ROS）水平失衡是損害老化骨組織再生的主要因素。在這項(xiàng)研究中，研究人員通過組裝可注射的聚（γ-谷氨酸）交聯(lián)氨基功能化聚（癸二酸甘油酯）水凝膠，開發(fā)了一種多層次ROS清除系統(tǒng)，該水凝膠含有負(fù)載雷帕霉素（PSeR）的聚（二硒化物-碳酸酯）納米膠束。Unisense微電極系統(tǒng)被用于測量血清的REDOX電位。REDOX電位是衡量氧化還原狀態(tài)的指標(biāo)，可以反映血清中氧化劑和還原劑之間的平衡。在老化和退行性疾病的研究中，了解血清的REDOX狀態(tài)對于評估細(xì)胞的抗氧化能力和氧化應(yīng)激水平是非常重要的。研究結(jié)果表明，這種創(chuàng)新系統(tǒng)有效地消除了細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，并在整個(gè)老化骨修復(fù)過程中維持了有利的細(xì)胞外氧化環(huán)境。此外通過ROS的多層次調(diào)控，我們成功地通過靶向細(xì)胞周期和DNA復(fù)制來干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）衰老。體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí)了PSeR在增強(qiáng)老化骨組織再生方面的功效。這項(xiàng)研究提出了一種通過ROS清除材料的設(shè)計(jì)來恢復(fù)衰老骨骼再生的新策略，并為促進(jìn)退行性相關(guān)疾病治療的治療概念提供了寶貴的見解。