反硝化厭氧甲烷氧化（DAMO）過程可以在厭氧條件下同步實現脫氮和CH4減排。該過程是一種獨特的反硝化反應，當硝酸鹽或亞硝酸鹽作為電子受體被還原為N2的同時，CH4作為唯一電子供體被氧化為CO.研究表明，DAMO過程對海洋沉積物中CH4的消耗減排占據了主導地位，且在濕地、河流、深水湖泊等自然生境以及農業土壤和廢水中均存在，該過程在全球碳氮循環的過程中起關鍵作用。DAMO微生物最早在淡水沉積物培養物中富集而得，起主導作用的功能微生物可以分為兩大類：NC10門細菌的Candidatus‘Methylomirabilis oxyfera’（M.oxyfera）和隸屬于ANME（anaerobic methanotrophic archaea,厭氧甲烷氧化古菌）中的一個簇ANME-2d的Candidatus‘Methanoperedens nitroreducens’（M.nitroreducens）。其中，DAMO古菌通常被認為只能將硝酸鹽（NO3-）還原為亞硝酸鹽（NO2-），因此需要與其他微生物協同作用以達到理想的脫氮效果。目前的研究表明，DAMO古菌可以與DAMO細菌協同進一步將NO2-還原為N2;同時，也已有研究發現在污水處理廠中DAMO微生物與厭氧氨氧化（Anammox）細菌共存現象，因此可以共培養DAMO古菌與Anammox細菌形成耦合系統，通過Anammox細菌進一步利用DAMO古菌產生的NO2-作為電子受體?污水中的NH4+作為電子供體產生N2,從而實現總氮的高效去除和溫室氣體的減量排放。

將硝酸鹽型~DAMO與厭氧氨氧化聯合應用，能夠在兩類優勢菌種的協同作用下將各種形式的氮轉化為N2,同時實現總氮去除和CH4減排。然而，在對Anammox-DAMO耦合系統的研究過程中檢測到了N2O,這說明并不是所有的氮都能轉化為N2被去除，而是在脫氮過程中生成了N2O這一中間產物。迄今為止的研究結果沒有證據表明厭氧氨氧化細菌在正常代謝過程中會產生N2O1-1.N2O作為反硝化過程的中間產物，一般認為在DAMO過程不會出現，這是因為DAMO微生物的代謝途徑特殊，DAMO細菌利用NO歧化酶將NO轉化為N2和O2,產生的O2再對CH4進行氧化，略過了中間體N2O的生成。雖然DAMO微生物中存在編碼N2O生成及降解的基因，但相關研究的實驗結果表明DAMO系統中有少量N2O的產生，然而降解N2O的基因卻未能表達。目前關于廢水處理過程中N2O產生的研究大多集中在傳統反硝化工藝，鮮少有人將研究聚焦于DAMO、Anammox等新型脫氮技術。

溫度變化會影響與N2O產消相關的微生物及酶的活性，從而引起N2O積累量的波動。有研究者利用A/O SBR反應器探究N2O隨溫度變化的產消情況，發現在15℃的低溫條件下N2O排放量比25℃時增加了1.9倍。Anammox與DAMO耦合脫氮過程中N代謝途徑較為復雜，不同溫度影響下該系統N2O的產消規律如何變化還有待探究。目前關于污水脫氮工藝中N2O排放的研究多集中在中低溫條件，然而在某些特定的氣候條件下高溫也會顯著影響廢水處理效果。本文以Anammox-DAMO系統為研究對象，探究中、高溫影響下該系統的性能與N2O產消變化規律，通過分子生物學手段及動力學機制探明N2O產消的代謝途徑，并提出N2O減排策略。

1材料與方法

1.1試驗裝置

批次試驗使用內徑7.0cm、高14.0cm,有效容積為250mL的厭氧子反應器（圖1）；連續試驗使用內徑16cm、高30cm、容積為3.5L的厭氧母反應器。反應器所有取樣口均設有閥門，閥門關閉時，反應器呈全封閉狀態，維持反應器內厭氧狀態，整個反應過程中使用磁力攪拌器進行連續攪拌，保證反應器內泥水混合均勻。

圖1試驗裝置

1.2接種污泥與營養液

試驗系統為以Anammox菌和DAMO古菌為優勢菌種的Anammox-DAMO系統，以西湖底泥?杭州西溪河底泥與農田水稻土壤的混合污泥為接種物，在厭氧條件下供給CH4?NO3-和NH4+,試驗期間系統運行穩定。

營養液新鮮配制，使用前氮吹30min以排除O2,組成如下：KH2PO40.05g/L;CaCl2·2H2O 0.3g/L;MgSO4·7H2O 0.2g/L;NaHCO31.05g/L;微量元素含量為1.25mL/L.微量元素包括（g/L）：15 EDTA,0.43 ZnSO4·7H2O,0.24 CoCl2·6H2O,0.99 MnCl2·4H2O,0.25 CuSO4,0.22（NH4）6MoO24·4H2O,0.19 NiCl2·6H2O,0.067 SeO4,0.014 H3BO3,0.05 Na2WO4·2H2O.營養液以去離子水為溶劑配制。

1.3試驗方法

1.3.1批次試驗為了研究溫度對系統的短期影響，并建立溫度影響下N2O產消動力學模型，進行為期10d的批次試驗。從母反應器中各取200mL泥水混合液注入厭氧子反應器中，各子反應器的NO3-和NH4+起始濃度為20mg/L,CH4濃度為80mg/L,pH=7.0,試驗溫度分別設置為20,25,30,35,40℃，每組設3個平行。試驗期間，每24h取氣樣3.0mL,水樣3.0mL,經0.22μm微孔濾膜過濾后測定NO3--N?NO2--N及NH4+-N濃度，同時監測系統中CH4含量以及N2O濃度變化。

1.3.2連續試驗基于批次試驗結果，篩選出反應效率最優以及N2O積累量最多的兩組具有代表性的溫度條件進行連續試驗，以揭示溫度對Anammox-DAMO系統的長期影響。以DAMO微生物倍增周期25d為一個實驗周期進行3個周期實驗，保持各系統pH值為7.0——7.2.每48h取各反應器水樣5.0mL,氣樣4.0mL,利用紫外分光光度計和氣相色譜儀分別測定NO3--N、NO2--N、NH4+-N、CH4、N2O的含量。以7d為一個加藥周期，每7d補充一次NO3-、NO2-、CH4.在試驗前中后期分別取泥水混合物30mL,熱提法提取EPS提取液后測量含蛋白質（PNs）和多糖（PSs）的胞外聚合物（EPSs）的組成以及濃度變化。在連續試驗前、中、后期分別取5mL污泥樣品進行高通量測序分析。

1.4分析方法

NO3--N、NO2--N和NH4+-N濃度使用雙束紫外~可見分光光度計（TU1901）按照標準方法測量。使用氣相色譜儀（GC2030,島津）測量頂空N2O含量以及CH4含量。采用pH計（梅特勒FG2）監測反應器內pH值的變化。采用熱提法分離EPS.PNs和PSs的測定方法分別為福林酚試劑法和蒽酮法。通過Usearch軟件和Gold數據庫將剩余序列聚集到操作分類單元（OTU）中。利用E.Z.N.A.®土壤DNA試劑盒（Omega Bio-tek,美國）進行樣品DNA抽提進行后續宏基因組測序。Illumina NovaSeq測序平臺用于宏基因組測序。

1.5動力學模型

采用酶動力學方程模擬NO3-、NH4+的還原以及N2O的產生和還原，如式（1）所示。

式中：RER為酶活性函數；Vmax,R為相應還原酶反應的最大比合成/活化速率，d-1;KE,i為酶誘導的半飽和常數，mg/L;KI,R為相應還原酶抑制系數，mg/L;Ci為底物的水相濃度，mg/L;R為還原酶（即Nar、Nir、Nos）；i為相應底物（即NO3-、NH4+、N2O）；CT為溫度變化因素。

2結果與討論

2.1溫度對Anammox-DAMO系統性能及N2O產消的影響

2.1.1溫度對Anammox-DAMO系統性能的影響根據厭氧氨氧化微生物和DAMO微生物的最適生長溫度條件4-2,選擇20——40℃進行短期試驗，對試驗結果進行單因素方差分析。從圖2可見，NO3-、NH4+、CH4的降解速率均隨溫度的升高先增大后減小，而N2O的濃度峰值整體呈現先下降后上升的趨勢。系統在溫度為40℃時，N2O的濃度峰值達到最大。對溫度影響下的批次實驗結果進行單因素方差分析，發現40℃溫度條件對N2O排放量的影響最大，另外對各環境因素進行正交實驗，結果顯示30℃為該系統脫氮性能最優的溫度條件，因此將30℃作為對照組，40℃作為實驗組進行長期試驗研究，以探明不同溫度條件下Anammox-DAMO系統性能及N2O產消規律。

圖2短期試驗溫度對Anammox-DAMO系統污染物降解及N2O峰值影響

圖3（a）和圖3（b）表明，Anammox-DAMO系統在40℃高溫條件下的脫氮性能要低于30℃，但隨著時間的推移，R2系統的脫氮性能較前期有提升，這說明該體系可以逐漸適應高溫的脅迫，這主要歸因于微生物會在極端環境下產生特殊的蛋白質和酶來幫助細胞抵御脅迫。有研究表明，瞬時高溫沖擊會對Anammox菌的活性產生抑制作用，但長期運行下系統的性能逐漸恢復，這說明Anammox菌具有緩解高溫抑制的內部機制。R2系統受到高溫的影響，在反應過程中出現了亞硝酸鹽的積累，平均積累濃度為（1.43±0.47）mg/L.從圖3（c）可知，R2系統中的硝酸鹽、氨氮、CH4降解速率均低于R1系統，說明高溫對系統中微生物活性產生了抑制作用，影響了其正常代謝。有研究表明，Anammox活性（SAA）會隨著溫度的升高呈現先升高再降低的趨勢，溫度對Anammox菌群蛋白質變化情況的影響也說明了Anammox菌的活性在高溫下受到抑制。有研究探究了溫度對Anammox-DAMO共培養系統的影響，結果表明溫度對耦合系統的影響同樣呈先上升后下降的趨勢，在高溫下微生物活性降低8-3.

圖3長期試驗溫度對Anammox-DAMO系統中污染物降解影響

在兩個系統的長期運行過程中均檢測到了硝酸鹽異化還原為銨（DNRA）反應，DNRA是一個特殊的生物反應過程，使用亞硝酸鹽作為中間物將硝酸鹽還原成銨1-3.在R1系統中，硝酸鹽降解速率為0.08mmol/（L·d），氨氮降解速率為0.05mmol/（L·d），CH4降解速率為0.04mmol/（L·d），CH4降解速率與硝酸鹽降解速率實際比值（1:2.00）與DNRA反應的理論比值（1:2.10）相符，說明在R1系統中同時存在DAMO、Anammmox、DNRA反應。R2系統中硝酸鹽降解速率為0.06mmol/（L·d），氨氮降解速率為0.04mmol/（L·d），CH4降解速率為0.03mmol/（L·d），也觀察到了相同的結果，證明了DAMO、Anammmox、DNRA反應的共存。

2.1.2溫度對Anammox-DAMO系統N2O產消的影響由圖4可知，2個系統均觀察到了明顯的N2O產消，且R2系統中N2O的總體累積量大于R1系統，其中R1系統N2O平均峰值濃度為（4.86±0.30）mg/L,R2系統為（6.85±0.59）mg/L.

相比于R1系統，R2系統產生了更多的N2O,研究表明，在N-DAMO系統中，nrfA的轉錄水平隨亞硝酸鹽濃度的增加而顯著上調，推測在R2系統中DAMO古菌為了應對亞硝酸鹽的脅迫加劇了DNRA反應的發生。在高濃度亞硝酸鹽影響下DNRA過程會生成NO,出于對NO的解毒作用，DNRA將NO轉化為N2O.Pereira在研究操作條件對厭氧氨氧化系統N2O產生的影響過程中發現亞硝酸鹽是N2O生成和積累的關鍵，這主要歸因于AOB中由細胞色素P460（CytL）催化的厭氧羥胺（NH2OH）解毒途徑。Ding等也發現N2O釋放率與亞硝酸鹽濃度呈正相關，這是因為亞硝酸鹽和N2O會競爭電子，當用于亞硝酸鹽還原的電子通量高于用于N2O還原的電子通量時，N2O就會積累。同時，在亞硝酸鹽和硝酸鹽共存的情況下，亞硝酸鹽和硝酸鹽還原酶之間對電子供體的競爭也可能導致N2O的不完全還原。另外，由于受到高溫影響，Anammmox細菌活性受到抑制，易造成中間產物NO的積累，為了防止NO對微生物造成毒害作用，Anammox細菌將NO轉化為N2O,因此在R2系統中產生更多的N2O。