2.2溫度對Anammox-DAMO系統N2O產消過程中EPS的影響

2.2.1溫度對Anammox-DAMO系統EPS變化的影響EPS是一種高分子量聚合物，主要由多糖（PS）和蛋白質（PN）組成，可用作保護層，以減弱惡劣環境對微生物的脅迫。此外，EPS在微生物的生物膜形成?粒化和穩定性中起重要作用。由圖5可知，兩個系統中PN含量的變化占主導地位，PS含量整體變化幅度并不明顯，PN含量隨著時間的推移先升高后降低，這是由于該體系在試驗前期需要通過增加PN含量來維持穩定性。與R1系統不同，在R2系統中，PN含量在中、后期都較初期有更大的增加幅度。

圖5 Anammox-DAMO系統中EPS含量變化

總體而言，R2系統在中后期PN和PS的含量都高于R1系統，隨著溫度的增加，蛋白質和多糖溶解并從污泥中釋放出來。R2系統中PN的量要比R1系統顯著高很多（P<0.05），這是由于高溫脅迫下導致R2系統產生更多的PN以適應環境條件。在整個過程中，各組PN均高于PS,這與其他研究相似0,4.結果表明，R2系統中期的EPS與初期對比起來有所增加，PS含量穩定在4.9mg/L,PN含量由6.6增加到11.3mg/L,可見，相較于PS,高溫沖擊對PN的影響程度更大，這主要歸因于微生物對惡劣環境的自我保護機制。作為影響細胞表面電荷和疏水性的一個因素，較高的PN提高了Anammox-DAMO系統中微生物的粘附性，并減輕了溫度沖擊對Anammox-DAMO系統微生物的損傷。

R2系統在高溫脅迫下產生更多的EPS,導致N2O擴散進入細胞內部的傳質阻力增加，N2O還原酶的作用時間縮短使得N2O排放量升高，這與Sabba等的研究結果一致。

2.2.2溫度對Anammox-DAMO系統可溶性蛋白影響圖6（a）和6（b）為初期（0d）的三維熒光圖，發現發射峰位于300——350nm處，激發峰位于250——300nm處，通過與其他研究中熒光組分的激發和發射最大值位置進行比較，該范圍內顯示熒光激發峰的物質為蛋白質5-4,其中激發峰在250——340nm,發射峰在280——380nm處主要包含物為酪氨酸和色氨酸。激發峰在220——340nm,發射峰在380——520nm處主要包含物為腐殖酸7-5.根據實驗結果可知初期實驗測得的主要物質是酪氨酸/色氨酸。

圖6溫度對Anammox-DAMO系統可溶性蛋白影響

從圖6（c）中可知，R1系統三維熒光發射峰位于300——400nm處，激發峰位于250——350nm處，主要物質為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物以及多糖。圖6（d）顯示R2系統三維熒光發射峰位于300——450nm處，激發峰位于200——350nm處，主要物質為酪氨酸/色氨酸、微生物代謝物、多糖以及富里酸。由圖中可得出EPS中蛋白質的熒光強度明顯大于多糖?腐殖酸，說明系統中微生物更多的產生蛋白質來適應溫度變化對其影響。且R2系統中期的熒光信號要明顯強于初期，并且強于同時期的R1系統的熒光信號，表明高溫會對反應器中的微生物活動產生影響，從而干擾有機物的分泌，產生更多的酪氨酸/色氨酸。有研究表明色氨酸類和酪氨酸類蛋白質物質與N2O的排放量呈顯著正相關關系1-5,因此R2系統中更高的N2O產生量可歸因于更多酪氨酸/色氨酸的生成。

從圖6（e）可知R1系統三維熒光發射峰位于300——400nm處，激發峰位于200——350nm處，主要物質為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物以及多糖。圖6（f）顯示R2系統三維熒光發射峰位于300——400nm處，激發峰位于250——350nm處，主要物質為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物?多糖。R2系統末期的熒光信號與中期相比逐漸減弱，逐漸恢復到初期水平，并與R1系統的熒光信號無顯著性差異，表明R2中的微生物逐漸適應高溫環境，這與系統性能的惡化與恢復趨勢一致。

2.3溫度影響下Anammox-DAMO系統N2O產消的生物學機制

2.3.1溫度對Anammox-DAMO系統微生物群落變化的影響如圖7（a）所示，R1和R2的優勢菌門均為Proteobacteria,且分別占比33%和40%,它是厭氧氨氧化系統常見的一大門類，且有研究表明Proteobacteria大多數是反硝化細菌，并且Proteobacteria中的大部分菌可以參與甲烷氧化過程，普遍存在于污水處理廠脫氮除磷工藝中。第二優勢菌門是Chloroflexi,分別占比14%和17%,它的作用是在細胞生長過程中降解有機分子或分泌可溶性化合物。在溫度的影響下，R2系統中的Firmicutes、Chloroflexi、Bacteroidetes和Euryarchaeota等嗜熱微生物豐度上升。相反在高溫脅迫下Actinobacteria和Ignavibacteriae的豐度相比R1有所下降，說明高溫環境不利于其生存。

圖7微生物相對豐度分布

圖7（b）顯示2個系統中均發現了芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonad）、食酸菌屬（Acidovorax）、陶厄氏菌屬（Thauera）、甲基單胞菌屬（Methylomonas）、Methanoperedens nitroreducens、叢毛單胞菌屬（Comamonadaceae）、特呂珀菌屬（Truepera）、Kuenenia、甲烷微菌屬（Methylomicrobium）。Acidovorax是常見的反硝化菌，Thauera是自養型反硝化細菌4-5,相比于R1系統，這兩種菌屬豐度在R2系統中均有所下降，表明高溫環境會抑制其生長。Tanikawa等認為Acidovorax和Thauera是反硝化過程中主要的N2O還原劑，Zhao等在Thauera中檢測到了大部分N2O還原酶編碼基因，證明了Thauera在N2O還原過程中的巨大貢獻，R2系統中Thauera豐度的下降是N2O積累量更多的原因。另外，有研究證明Bacillus可能在N2O排放方面發揮巨大作用，本文在R2系統中檢測到了該屬更高的豐度，這也是導致N2O排放量更高的重要原因。Methylomonas中存在亞硝酸鹽還原酶，其在R2系統中的豐度明顯低于R1系統，導致R2系統亞硝酸鹽大量積累。Methanoperedens nitroreducens已知為進行硝酸鹽驅動的厭氧甲烷氧化的n-DAMO古菌，在R1系統中的占比為23.22%,在R2系統中的占比為16.40%,由此可見高溫抑制了DAMO古菌的生長，造成脫氮速率下降。Ca.Kuenenia和Ca.Brocadia與脫氮直接相關，是常見的Anammox細菌，在R1系統中兩者的占比分別為17.64%和12.47%,在R2系統中兩者的占比分別為19.01%和16.65%,可以看出Anammox兩個菌屬在R2中占比升高。這可能是因為DNRA反應產生的銨促進了Anammox微生物的生長。在兩個系統中均未檢測到能夠進行DNRA反應的典型微生物，因此推測DAMO古菌利用甲烷厭氧氧化產生的電子發生了DNRA反應。

2.3.2溫度對Anammox-DAMO系統微生物功能基因豐度變化影響反硝化過程主要由4種酶催化，即硝酸鹽還原酶（narGHI/napAB）、亞硝酸鹽還原酶（nirK/nirS）、NO還原酶（norBC）和N2O還原酶（nosZ）。nrfA是DNRA的分子標志物，由圖8可見，其在R2系統中相對豐度較高，對高溫條件表現出明顯的偏好性，Lai等將溫度從10℃提升到40℃時，nrfA基因豐度增加，DNRA反應過程增強，說明DNRA反應與nrfA基因豐度呈顯著正相關。對于硝酸還原酶基因，相較于R1系統，R2系統中的napAB轉錄明顯上調，顯示了對DNRA的主要貢獻（硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽），然而narGHI的表達水平與R1系統幾乎一致，表明對部分DNRA的貢獻較小。對于亞硝酸還原酶基因，nirSK在R2系統中的相對豐度低于R1系統，減弱了R2系統對亞硝酸鹽還原能力進而導致亞硝酸鹽積累，這主要歸因于高溫會顯著降低nirK基因的豐度。另外，在R2系統中，NO還原酶基因（norB）相對豐度更高，而N2O還原酶基因（nosZ）相對豐度較低，說明高溫條件抑制了nosZ酶的生成，進而阻礙了N2O被還原。hdh和hzs是參與Anammox反應的酶，其中hzs在R2中的相對豐度高于R1系統，且與nrfA的變化呈正相關關系，表明DNRA反應產生的銨為Anammox提供了底物，從而促進Anammox過程的發生。

圖8不同溫度下氮代謝和碳代謝功能基因豐度

在R2系統中，Anammox基因豐度高，但脫氮性能卻比R1差。這種現象可以通過不利的溫度和FNA對轉錄、翻譯和酶活性的抑制來解釋。以亞硝酸鹽還原酶與N2O還原酶的比值（Σnir/nos）作為N2O產生潛力的指標，其中Σnir/nos是由nir基因（nirS+nirK）之和除以nos基因測定的。結果表明R2系統中Σnir/nosZ（1.95）高于R1系統（1.49），說明Anammox-DAMO系統在高溫脅迫下更易積累N2O.

2.4溫度影響下Anammox-DAMO系統動力學機制及N2O減排調控策略

2.4.1溫度影響下Anammox-DAMO系統動力學機制如圖9及表1、2、3所示，NO3-、NH4+和N2O酶動力學方程中Vmax均隨著溫度的升高先增大后減小，在35℃時最大，40℃時最小，意味著硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、N2O還原酶均在35℃時擁有最大比合成/活化速率，酶活性最強。KI,R為對應還原酶的抑制系數，3種酶動力學方程的KI,R隨溫度的升高先降低后升高，同樣在35℃時最大，40℃時最小，表明35℃的溫度條件對3種酶的抑制作用最小。3種酶動力學方程的半飽和常數KE,i隨著溫度的升高先減少后增加，在35℃時最小，40℃時最大。

表1不同溫度下NO3-降解酶動力學參數

表2不同溫度下NH4+降解酶動力學參數

表3不同溫度下N2O消耗酶動力學參數

圖9酶動力學擬合曲線

硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、N2O還原酶的活性均隨著溫度的升高呈現先增強后減弱的趨勢，且在35℃時活性達到最大，意味著在此溫度下Anammox-DAMO系統的脫氮性能最好，N2O還原效果最好，能夠實現最大程度減少N2O排放量。低于或高于35℃的溫度條件都會對酶的活性產生不利影響，造成系統性能的惡化以及N2O的積累，擬合結果印證了短期試驗結果。Hu等利用實驗室規模的缺氧/好氧間歇式反應器探究了溫度對N2O排放的影響，結果表明在10——35℃的溫度條件下，N2O排放量隨溫度的升高而降低，該系統主要是通過溫度變化影響硝化和反硝化的總體過程速率來影響N2O的排放，本研究在該溫度范圍的基礎上繼續擴大溫度范圍，發現在20——40℃的范圍內，系統在35℃時出現N2O排放低谷。此外，Qian等在TDD-Anammox耦合工藝中發現35℃時系統N2O排放量最少，這主要歸因于Anammox微生物（其特征是不產生N2O）在此溫度下發揮最大作用，而本研究酶動力學擬合結果證明了參與Anammox過程的亞硝酸鹽還原酶在35℃下活性最大，與其實驗結果相符。

綜上所述，動力學模型可以很好地預測系統在不同溫度下N2O排放情況，根據酶動力學擬合結果推測出N2O排放量最少的溫度條件為35℃，在此溫度下該系統可以最大程度地實現N2O減排。

2.4.2 Anammox-DAMO系統代謝途徑及N2O調控策略根據檢測到的功能菌和基因，通過比對KEGG數據庫的注釋對溫度影響下Anammox-DAMO系統特殊氮代謝途徑進行分析（圖10）。

圖10 Anammox-DAMO系統特殊氮代謝途徑

在Anammox-DAMO系統中，除已被證實的Anammox-DAMO氮代謝基因，還檢測到了與DNRA反應相關的nrfA基因，且在高溫脅迫下其豐度顯著增加。研究表明DAMO古菌有編碼nrfA的基因，因此具有發生DNRA反應的潛力。高溫抑制了Anammox-DAMO系統中nir酶的活性，造成亞硝酸鹽積累，基于nrfA的解毒機制，此時nrfA會將NO2-還原為NO,nrfA與活性位點血紅素c基團A結合的晶體結構將NO轉化為N2O.在本研究中還檢測到了與N2O產消相關的norB、norC和nosZ基因。有研究表明，Anammox細菌會生成中間產物NO,norB和norC基因可能會對外部亞硝化應激做出快速反應，為了將NO維持在毒性水平以下會把NO轉化為N2O.高溫影響下，Anammox細菌產生的NO促進了norBC基因豐度增加，進而將更多的NO轉化為N2O.與此同時，Anammox-DAMO系統中的nosZ基因豐度降低，說明高溫抑制了N2O還原酶的生成，導致無法及時將產生的N2O還原，造成N2O凈排放量升高。綜上所述，N2O產生和消耗途徑可作如下解釋：Anammox-DAMO系統中檢測到的N2O由DNRA反應及Anammox細菌對NO解毒作用產生，而N2O的消耗大部分由編碼nosZ基因的微生物完成。

基于Anammox-DAMO系統中N2O特殊的產消代謝途徑，本研究發現高濃度亞硝酸鹽脅迫是導致Anammox-DAMO系統N2O積累的主要原因。高溫通過影響系統氮代謝過程中的關鍵功能基因酶的活性，導致亞硝酸鹽濃度升高，進而觸發DNRA反應及Anammox細菌的解毒作用。反硝化過程中4個還原步驟之間的電子競爭以及不同還原酶的活性決定了N2O的積累程度，本研究中，對系統性能不利的高溫條件會顯著降低N2O還原酶的活性，導致N2O的凈排放量升高。因此，盡可能控制系統在運行過程中維持在中溫條件，豐富具有較強N2O還原能力的微生物群，可以促進N2O的還原。在后續研究中，還需要優化pH值、C/N、DO、FNA等其他操作條件，避免運行過程中亞硝酸鹽的積累，并研究不同操作條件下N2O還原酶的活性，以最大限度地減少廢水處理中N2O的產生。

3結論

3.1高溫顯著降低了Anammox-DAMO系統的脫氮性能，且在高溫脅迫下系統中亞硝酸鹽積累進而導致N2O的凈排放量升高，根據甲烷與硝酸鹽降解速率比值可知該系統在長期運行過程中還存在DNRA反應。

3.2 Anammox-DAMO系統中微生物在高溫脅迫下產生更多的蛋白質以緩解惡劣環境造成的損傷，三維熒光光譜結果顯示其主要為色氨酸類和酪氨酸類蛋白質物質，該類物質的分泌與N2O的排放量呈顯著正相關。

3.3高通量測序結果表明，在高溫影響下系統中與N2O還原相關的Acidovorax和Thauera屬豐度降低，而與N2O產生相關的Bacillus屬豐度則上升。宏基因測序結果表明高溫降低了nirSK豐度，造成亞硝酸鹽積累，此外在高溫條件下norB豐度增加而nosZ豐度減少，加速了N2O生成的同時抑制了其還原，導致N2O積累。

3.4在不同溫度下對Anammox-DAMO系統進行酶動力學擬合，發現低溫和高溫均會增加N2O的凈排放量，而在35℃時可以最大程度地實現N2O減排。