2、納米模擬酶在活性氧檢測中的應用

2.1超氧陰離子（·）的檢測

Sadeghian等制備了一種三維納米金網電化學傳感器（圖3）。多孔金納米網（NPGM）上附著Cyt-c并與工作電極結合，來測量藥物誘導C2C12細胞的·通過多孔膜的釋放速率。該傳感器對·的靈敏度為7.29 nA/（nmol/L·cm2），最低檢出限為70 pmol/L。該工作通過改變納米金的的形貌來增加比表面積，提高了該超氧化物傳感器的電化學性能。這項工作將為開發高靈敏度的分子電化學生物傳感器提供了一個平臺。

圖3細胞外超氧化物的電化學檢測（a）通過氧化還原蛋白（Cyt-c）與電極之間的氧化和直接電子轉移來實現的傳感機制；（b）細胞被界面連接功能化電極示意圖

除了上述提到的Au NPs以外，Pt NPs也可作為·的催化劑與石墨烯相結合作為類超氧化物歧化酶。2019年，Hu等通過電沉積將Pt NPs沉積在三維石墨烯泡沫（3D GF）上構建原位檢測·的三維傳感平臺。Pt 3D GF具超強的電化學活性，能使電荷轉移電阻降低85%，且3D GF是一個具有生物相容性的平臺，有較高的表面積且適合細胞附著/生長。該平臺有明確的表面和界面特性，可實現從細胞中釋放的·的現場監測。此外，研究發現，在3D GF上沉積Pt NPs，減少了帶負電荷的·和電極表面之間的排斥力，使得3D GF有更高的電子轉移速率和更好的電催化活性。

圖4鈷納米復合材料的制備及其對·檢測流程圖

相比于MOFs的不斷改進，將磷酸錳與其他生物技術相結合應用于對·的電化學傳感也是一個較好的方向。Wang等構建了一個基于細菌纖維素脫氧核糖核酸-磷酸錳（BC DNA-Mn3（PO4）2）的絲網印刷電極的活細胞傳感界面?；罴毎还潭ㄔ贐C DNA-Mn3（PO4）2納米酶傳感平臺上，以快速、可靠地檢測活細胞釋放的·。該類傳感器在小型化、生物相容性、成本低和實時監測方面具有巨大的潛力。這項研究進一步表明，現有的構建活細胞傳感界面的方法在未來的原位檢測技術和下一代智能生物芯片、疾病診斷方面具有十分廣闊的前景。

近年來，研究人員使用電化學技術將納米模擬酶與特定的傳感元件結合用于開發檢測·的電化學傳感器。將有機材料與無機材料相結合用于改善電化學傳感器的線性范圍窄、檢測限不夠低等缺點，并提高傳感器對·的選擇性、穩定性。表1展示了用于·檢測的不同修飾電極的性能比較。

表1用于·檢測的不同修飾電極的性能比較

2.2羥基自由基（·OH）的檢測

·OH在高級氧化過程（advanced oxidation processes）中作為主要氧化劑降解持久性污染物。但同時·OH也會破壞碳水化合物、核酸、脂類和氨基酸等生物分子，并對生物體和人類造成極大危害。·OH被認為是生物系統中產生的最強大的具有潛在危險的ROS，過量可能會導致細胞損傷?！H的濃度也與各種癌癥、糖尿病和神經退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ『团两鹕。┯嘘P，了解·OH濃度與這些疾病之間的關系有助于更好地診斷和預防。因此，開發能夠快速分析·OH的靈敏檢測方法是非常重要的。

Huang等通過構建一個使用DNA和6-巰基己醇（MCH）的生物傳感器，證明了DNA氧化損傷的程度與·OH的濃度有關。他們以氮摻雜的多孔碳材料和AuNPs作為信號放大器，進一步提高了電化學探針的靈敏度和最低檢出限。通過電化學探針［Ru（NH3）評估·OH誘導的DNA損傷。該傳感器具有良好的電導率，其檢測限為25.0μmol/L。

盡管上述基于DNA的生物傳感器很容易制備，但DNA存在易降解等缺點，這極大地限制了它的實際應用?？寡趸瘎┍徽J為是防止自由基損傷的還原劑，Abdel-Hamid等將咖啡酸（CAF）作為抗氧化劑，通過清除自由基來防止·OH的形成，這可以保護DNA不被降解。為了研究雙鏈DNA（dsDNA）與咖啡酸（CAF）的相互作用并評估抗氧化性能，采用多壁碳納米管固定dsDNA并作為玻碳電極修飾材料。在本研究中，同時研究了·OH對DNA造成的氧化損傷，并觀察到在加入CAF后，由于其清除·OH的特性，ds-DNA受到保護。該項工作能夠構建生物傳感器用于鑒定DNA損傷，對癌癥、病毒感染等疾病的預防具有非常重要的參考意義。

除了通過直接的DNA氧化損傷程度來檢測·OH的濃度外，還可以通過檢測其他·OH捕獲物來間接檢測和判斷·OH的濃度。Li等將羧基功能化石墨烯（CFG）通過自組裝單分子膜技術（SAMs）與乙二胺（NHCH2CH2NH）共價相互作用固定在玻璃碳電極（GCE）上，得到快速、靈敏檢測·OH的CFGNHCH2CH2NH/GCE電化學傳感平臺。在測定過程中，·OH的濃度不是直接獲得的，而是采用4-羥基苯甲酸（4-HBA）作為·OH捕獲物，間接測得·OH。

Duanghathaipornsuk等提出了一種超靈敏的電化學傳感器。該傳感器由超小氧化鈰納米團簇（＜2 nm）電沉積在絲網印刷碳電極（SPCE）上構筑而成。該電化學傳感器的檢測限（LOD）為0.6μmol/L。此外，該納米氧化鈰電化學傳感器在體外成功檢測到新生小鼠骨組織的成骨細胞中存在·OH。為了最小化Ce NPs的尺寸，從而最大限度地增加用于·OH清除和檢測的Ce3+位點的數量（式（1），（2）為氧化鈰與羥基自由基反應原理），該團隊采用表面有機金屬化學（SOMC）合成策略來獲得納米級的CeOx，通過控制有機金屬前體的負載來調整CeOx納米團簇的大小和分散性。超靈敏電化學傳感器有望應用于醫療診斷、燃料電池技術以及食品和化妝品行業。

在活性氧檢測領域，對·OH的檢測相對偏少，這是因為·OH具有較高的化學反應性，壽命極短（在生物系統中約為15 s），且難以在模型系統中進行檢測并研究其與DNA損傷的關系。在眾多研究中Ce NPs對·OH具有極高的選擇性，這為·OH的檢測提供了新思路。另外還可以通過直接判斷DNA的損傷程度來檢測·OH濃度或通過·OH捕獲物間接檢測·OH。表28，64，66-6展示了用于·OH檢測的不同修飾電極的性能比較。

表2用于·OH檢測的不同修飾電極的性能比較

2.3 H2O2的檢測

H2O2是一種簡單、重要且功能強大的氧化劑，廣泛應用于化工、臨床應用、藥物分析、食品制造和環境保護等多個領域。它不僅在化學和工業過程中產生，而且是人體中多種氧化代謝途徑的副產物。為了保證生物功能的正常，H2O2濃度必須低于100 nmol/L，高于此濃度會導致細胞的氧化應激和損傷從而導致嚴重疾病（如癌癥、糖尿病、阿爾茨海默病和帕金森病等），甚至加速衰老。因此，實現快速、準確的檢測H2O2至關重要。以下介紹幾種用于檢測H2O2的電化學傳感器：

MOFs對H2O2的氧化表現出獨特的電催化活性。Sherino等制備了一種以己二酸（adipic acid）為連接劑和哌嗪（piperazine）為載體的鎳金屬有機材料（APNi-MOF），并將其用作檢測H2O2的電極材料（AP-Ni-MOF/CPE）。AP-Ni-MOF具有1.28×10－3S·cm－1的高電導率，對H2O2的檢測具有很高的電化學活性。AP-Ni-MOF/CPE檢測范圍是0.004～60 nmol/L，檢測限為0.0009 nmol/L。AP-Ni-MOF/CPE電極在H2O2的實際樣品檢測（透鏡清潔劑溶液）中表現出了良好的重現性、穩定性和選擇性。Liu等開發了一種新型的卟啉鐵金屬有機框架（pFeMOF）修飾的有序介孔碳（OMC），用于檢測活細胞釋放的H2O2。該pFeMOF/OMC復合材料是通過簡單的一步水熱法制備而成，Fe（Ⅲ）離子與卟啉基團的羧酸鹽具有很強的配位作用，可以使合成的MOFs更加穩定。pFeMOF可以模擬過氧化物酶特性，獲得良好穩定的電化學信號。此外，通過引入了OMC提高pFeMOF的導電率，同時OMC可以有效地控制pFeMOF晶體生長。這一策略改善了pFeMOF團聚從而使得更多的活性位暴露，提高了該復合材料的電化學活性。

在各類納米金屬與不同材料相結合的功能結合型材料中，除了金屬框架的MOF外，碳基金屬材料的導電性能也非常優異。Zhang等將一維金納米粒子（AuNPs）組裝在磁性氮摻雜碳納米管（NCNTs）上，再與細胞色素c（Cyt-c）結合制備出基于Cyt-c/NCNTs Fe3O4 Au的傳感器。其引入的AuNPs不僅不會破壞Cyt-c的天然結構，還能增強Cyt-c在電極表面的電催化特性。該傳感器用于檢測H2O2，其檢測限低至0.3μmol/L。

與同為碳基材料的碳納米管相比，石墨烯具有更大的比表面積與穩定性，Zhao等報告了一種快速制備銀納米粒子錨定激光誘導石墨烯（LIG Ag）電極的方法，并用于H2O2檢測。通過偏焦激光燒灼方法，銀納米粒子可以均勻分布在具有缺陷和微孔的層狀結構的LIG納米片上，LIG可以抑制銀納米粒子的尺寸增加，同時銀納米粒子也可以防止石墨烯納米片的團聚。Ag NPs和LIG納米片的協同效應使LIG Ag電極在許多方面呈現出優異的電化學性能。該傳感器具有良好的穩定性、重復性、選擇性，對H2O2的檢測限約2.8μmol/L，靈敏度為28.6μA（mmol/L·cm2）。由于LIG Ag電極具有優異的導電性、機械靈活性和輕質等特點，該方法為大規模制造智能傳感設備提供了一種新思路。

H2O2檢測已經在工業領域和生物研究中獲得了廣泛的應用。在各種H2O2檢測策略中，電化學因其高精確度和可靠性、良好的靈敏度和選擇性、低檢測限、快速反應和小型化引起越來越多的關注。隨著納米材料的快速發展，各種納米材料被作為納米模擬酶應用于生物傳感領域。表3為用于H2O2檢測的不同修飾電極的性能比較。

表3用于H2O2檢測的不同修飾電極的性能比較

3、總結與展望

納米酶已成為廣泛用于各種領域的熱門材料。特別是在生物傳感領域，與天然酶相比，納米模擬酶因其獨特的催化活性，在檢測活性氧的生物傳感器的構建及應用中發揮著重要作用。部分納米模擬酶作為電化學活性材料對一些特定的活性氧物質具有獨特的催化性能，受到研究者的廣泛關注。

隨著與納米模擬酶有關的研究迅速增加，納米模擬酶應用于ROS檢測的研究也取得了一定的進展，但在實際檢測過程種還存在著一些問題，具體如下：

（1）目前的研究大多集中在通過調節納米模擬酶的尺寸、形貌和結構來優化納米模擬酶對ROS的催化性能，對納米模擬酶中活性位點的研究還很缺乏。

（2）對納米模擬酶與活性氧的催化機理的研究還不夠深入，因此了解其催化機制對設計新型納米酶和調節其活性具有重要意義。

（3）納米模擬酶在應用過程中可能會與細胞內成分如蛋白質、核酸和小生物分子等發生相互作用，而導致其正常的生理功能的破壞。因此，有必要提高納米模擬酶的生物相容性，以開發出新型電化學生物傳感器，用于原位或實時檢測ROS。

本文總結了納米模擬酶在不同種類活性氧的電化學生物傳感器方面的最新進展，討論了其在當前研究中的不足之處，為今后的研究提供參考。我們期望對新型的納米模擬酶進行進一步的研究開發，以提高其性能，加快發展納米模擬酶在ROS檢測和分析中的應用。