[ 摘要]

近年來, 隨著研究的深入, 一氧化氮(NO)越來越多的生物學功能逐漸被發現。 以往國內外很多報道都證實 NO 在抗微生物感染方面起到重要作用, 然而近年來的一些發現表明, NO 對微生物的生長還起到保護作用, 這種保護作用體現在 NO 能促進細菌的耐藥及在氧化應激和壓力應激時對微生物的保護等方面。 本文綜述了 NO 對微生物生長影響作用的兩面性 及其機制的研究進展。

隨著一氧化氮(nit ric ox ide , NO)在促進血管舒張方面的 作用被發現, NO 的生理和病理作用逐漸受到人們的重視, 并 成為當前的一個研究熱點。 近年來對其在感染損傷方面作 用的研究亦取得了很大的進展。 傳統觀點認為 NO 是抗感 染損傷的一個重要分子, 在細菌、真菌、病毒等感染中, 活化 的巨噬細胞通過產生大量 NO 來殺傷微生物。 然而最近的 一些研究表明, NO 對于微生物的生長是有保護作用的, 這種 作用體現在 NO 在不良環境下對微生物的保護。 本文將從 殺傷和保護兩方面對 NO 影響微生物的生長進行闡述。

1、NO 對微生物的殺傷作用

作為活化巨噬細胞產生的一種細胞毒效應分子, NO 能 介導巨噬細胞抑制和殺傷細菌、真菌等微生物, 是機體抗感 染防御體系中的重要因子之一。 促使微生物自身體內產生 NO 也是藥物發揮氧化應激作用殺傷微生物的重要機制[ 1] 。

1 .1、 NO 對細菌的殺傷作用

Nameda 等[ 2] 用β -葡聚糖和 吲哚美辛誘導小鼠腹腔感染細菌, 導致感染性休克, 在應用NOS 抑制劑后, NO 代謝產物產量下降, 小鼠的死亡率升高。 用 NOS 抑制劑 2 周后, 小鼠各器官細菌的數量明顯上升 , 腹 膜細胞中 TNF -α、IL -1β 、IL -6 等的濃度上升。 Webert 等[3] 在小鼠氣管內滴入銅綠假單胞菌誘導肺炎的產生, 然后 將小鼠暴露在含有一定濃度 NO 的空氣中。 結果顯示, 與對 照組相比, 暴露在 NO 條件下的小鼠內誘導型一氧化氮合酶 (iNOS)活性下降, 但氮氧化物的水平明顯上升, 細菌數量明 顯減少, 白細胞浸潤程度降低, 而機體的氣體轉換沒有受到 影響。 Canthaboo 等[ 4] 用百日咳桿菌感染野生型小鼠和 iN- OS 缺失型小鼠, 結果顯示 iNOS 缺失型小鼠對百日咳桿菌更 為敏感。 Eng elsman 等[ 5] 在外科手術器具材料上添加 NO 釋 放涂層, 在體外實驗中能有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿 菌、銅綠假單胞菌等的感染, 但是在體內實驗中這種效果卻 不明顯。

1.2、NO 對真菌的殺傷作用

NO 對真菌的殺傷作用與細 菌相似。 Kim 等[ 6] 用血小板激活因子(PAF)預處理白假絲 酵母菌感染的小鼠, 導致 iNOS mRNA 和蛋白質的高表達。 當加入 NF-κB 抑制劑后, 這種效果被顯著地抑制。 PAF 預 處理小鼠避免了因白假絲酵母菌感染而引起的死亡, 腎臟中 真菌的增長也變緩。 然而加入 iNOS 抑制劑后及在 iNOS 缺 失小鼠中, PAF 的這種保護作用消失。 數據顯示 NO 在 PAF 誘導的保護機體抵抗白假絲酵母菌感染中發揮了重要作用。

在 NO 對微生物殺傷作用的研究中, 大量的研究集中于 機體通過巨噬細胞產生 NO 來殺傷侵襲的微生物 。 然而也 有一些研究指出, 促使微生物自身產生 NO 是藥物發揮氧化 應激作用來殺傷微生物的重要機制。 Osório 等[ 7] 研究指出 NO 在甲萘醌等誘導的酵母細胞凋亡中發揮重要作用:液泡 膜蛋白 Btn1p 在酵母空泡運輸精氨酸過程中發揮重要作用, BTN1 基因缺失型菌株對于甲萘醌、二酰胺、過氧化氫等引起 的氧化應激產生耐受。 實驗發現, 基因缺失菌相比野生型菌 株, 藥物作用后活性氧生成減少。 他們認為 BTN1 基因缺失 型菌株不能有效轉運精氨酸來合成 NO , 從而減少了氧化損 傷, 而外源加入精氨酸則能夠逆轉這種氧化耐受。 Almeida 等[ 8] 也認為 NO 在酵母細胞凋亡過程中發揮重要作用:他們 用過氧化氫誘導酵母細胞發生凋亡, 從中檢測到 NOS 的活 性升高, NO 的生成增加。 這種 NO 的生成依賴于左旋精氨 酸, 在加入 NOS 抑制劑后, 細胞 NO 生成量下降, 同時對過氧 化氫產生耐受。

1 .3、NO 對微生物殺傷作用機制

NO 是一種帶有不配對 電子的氣體自由基, 可與原核細胞和真核細胞內許多生物小 分子發生化學及生化反應, 包括氧化還原、離子移位和集團 修飾等[ 9] 。 生物體許多細胞如巨噬細胞、中性粒細胞都具有 iNOS , 在細胞因子的作用下這些細胞能夠產生 效應分子 NO , 殺傷微生物。

在病理條件下, NO 可以直接抑制微生物的有氧呼吸能 量代謝;在高濃度時, NO 還可以與體內產生的氧自由基等反 應生成活性氮氧化合物(RNOS), 再由活性氮氧化合物發揮 抗微生物感染作用。 例如 NO 與超氧陰離子(O2 -)反應, 生 成過氧亞硝基陰離子(ONOO -)或三氧化二氮(N2 O3)等一 系列物質, 介導氧化損傷或亞硝基化損傷[ 10] 。 ONOO -可有 效地氧化蛋白質巰基、Fe/ S 中心、鋅指結構、硝基化蛋白質的 酪氨酸殘基等, 使許多重要的蛋白質或酶失活, 影響細胞代 謝, 并抑制呼吸鏈酶, 破壞線粒體結構, 使 DNA 鏈斷裂, 對微 生物造成殺傷[ 11] 。 另外, NO 是活化巨噬細胞抑制和殺傷胞 內病菌的重要效應分子, 它可以通過誘導巨噬細胞釋放腫瘤 壞死因子(TNF)、白介素(IL)等炎癥介質介導免疫毒性反 應, 殺死病菌。

2、NO 對微生物的保護作用

以往關于 NO 對微生物生長影響的研究多著眼于 NO 對 微生物的殺傷方面, 然而最近的一些研究表明:NO, 尤其是 微生物自身產生的 NO, 對其抵抗外界惡劣環境、促進微生物 感染宿主, 甚至促進微生物耐藥等方面發揮重要作用。

2 .1、NO 對細菌的保護作用

Johnson 等[ 12] 的研究發現, 在 植物生長組織內會有纖維二糖(植物細胞壁的一種成分)的 生成, 而一些植物致病性鏈霉菌屬容易感染生長旺盛的植物 組織。 這些鏈霉菌會產生 NO 等活性氮類物質用于一種叫做 thax tomin 的生物合成, thax tomin 能夠抑制植物纖維二糖 的合成, 從而破壞了細胞壁的完整性, 促進細菌感染植物組 織。 然而在此過程中 NO 的作用尚未研究清楚。

Gusaro v 等[ 13 -15] 關于 NO, 尤其是細菌內源性 NO 對細 菌的影響做了長期細致的研究, 他們用 NO 預處理枯草桿 菌, 然后加以 H2O2刺激, 結果顯示用 NO 預處理細菌幾秒后 再加以 H2O2刺激能夠大幅提高細菌的氧化應激適應能力。 此外他們還認為內源性 NO 是維持細菌毒力和細菌在巨噬 細胞內存活的關鍵因素:他們比較了 NOS 缺失型和野生型 炭疽芽孢桿菌在小鼠體內的毒力以及巨噬細胞對其 DNA 的 損傷程度, 結果顯示 NOS 缺失型細菌感染小鼠所需的半數 致死量明顯增加, 巨噬細胞作用后 DNA 損傷也更加顯著。 另外, 他們關于內源性 NO 促進細菌產生耐藥性的報道更是 引起了人們的關注, 他們的研究發現:NOS 基因缺失型枯草 桿菌對于各種藥物的敏感性明顯上升, 而外源性加入 NO 后 細菌對藥物的敏感性降低, 他們認為這種 NO 促進細菌耐藥 作用具有廣譜性。 Husain 等[ 16] 的研究結果與上述結果相 似, 他們研究了沙門菌屬在氧化應激環境下存活的條件, 發 現用 NO 預處理細菌 , 阻斷有氧呼吸電子傳遞鏈, 增加細菌 內 NADH 的含量, 能夠使細菌耐受 H2O2導致的氧化應激。

2.2、NO 對真菌的保護作用

相對于 NO 對細菌的保護作 用, 關于 NO 對真菌 的保 護作用 的研 究報 道較 為少 見。 Chiang 等[ 17] 的研究表明微量的 NO 能夠降低金屬離子對釀 酒酵母的殺傷:他們用不同濃度的銅離子刺激釀酒酵母, 然 后加以不同濃度的 NO , 結果顯示低濃度的 NO 能夠降低金 屬離子的毒性, 對菌體起到保護作用。 Domitr ovic 等[ 18] 也研 究了 NO 對釀酒酵母的保護作用, 他們將釀酒酵母置于不同 的溫度環境及流體靜力壓下, 觀察其對于熱刺激及壓力刺激 的耐受能力。 結果顯示:預先用 NO 供體短時間處理酵母細 胞能夠增強其耐高溫和耐壓力刺激的能力。

2.3、NO 對微生物保護作用機制

NO 對微生物的保護作 用是最近幾年研究較為深入的一個方向。 然而其作用機制 目前尚未有統一的看法。 Gusar ov 等[ 13 -15] 認為 NO 促進細 菌耐受氧化應激的關鍵在于 NO 可以抑制芬頓效應。 芬頓 效應是一種在亞鐵離子(Fe2+)催化下 O2 -和 H2O2相互作用 生成羥自由基(OH ·)的反應 , NO 抑制了芬頓效應, 從而減 少了對細菌具有很強殺傷作用的 OH · 的產生。 此外 NO 還 可以增強過氧化氫酶的活性, 兩方面共同導致了細菌對過氧 化氫的耐受。 而 Husain 等[ 16] 并不認同此觀點, 他們認為 NO 阻斷 了細菌有 氧呼吸電 子傳遞 鏈, 增加了細 菌內的 NADH 的含量, 從而促進了氧化劑的還原, 阻止了氧化劑對 細菌的殺傷。 Chiang 等[ 17] 研究發現微量 NO 可以降低銅離 子對釀酒酵母菌的毒性, 認為 NO 抑制了銅離子介導的轉錄因 子 Mac1 的活性, 導致了對銅離子有高度親和性的轉運蛋白 Ctr1 的表達, 從而阻止了高濃度銅離子進入細胞。 Domitrovic 等[ 18] 認為 NO 增強酵母耐高溫和耐壓力刺激的機制并不相 同, 但共同的可能是 NO 在信號轉導過程中發揮了重要作用。

3、NO 作用的雙重性

NO 廣泛產生于各種生物細胞中, 在哺乳動物、細菌、真菌體內均有產生。 并在各種生物信號轉導過程中發揮重要 作用[ 19-20] 。 在關于 NO 與微生物生長之間關系的研究中, 人 們發現在不同的濃度、不同的環境下, NO 會對微生物的生長 造成截然不同的影響。 例如 Chiang 等[ 17] 的研究表明微量的 NO 能夠激活銅離子敏感性轉錄因子(Ace1), 加速金屬離子 的代謝, 從而降低金屬離子的毒性, 對細菌起到保護作用;而 高濃度的 NO 反而抑制 Ace1, 減緩金屬離子的代謝, 增加了 金屬離子的毒性。 目前 NO 對微生物生長所造成的雙重影 響尚待研究。 另外, 一些 NO 在微生物生長過程中起到了特 殊的作用, 例如 Barraud 等[ 21] 研究發現銅綠假單胞菌內源性 產生的 NO 能夠促使細菌由菌絲態向游離態轉換, 合理利用 NO 的這種性質, 將 NO 供體與殺菌藥合用可以增強藥物對 菌絲態細菌的殺菌效果。 此外, 不同的微生物, NO 所表現出 的作用可能也完全不同, 例如文獻[ 7 ,13 -15] 關于 NO 對于真菌 和細菌耐藥性的研究報道截然相反, Osó rio 等[ 7] 認為促使微 生物自身產生 NO 是藥物發揮氧化應激作用來殺傷微生物 的重要機制;而 Gusaro v 等[ 13 -15] 認為微生物自身能夠產生 NO 是增強細菌感染宿主, 甚至產生耐藥性的重要機制。 這 似乎是兩種矛盾的觀點。 但仔細推敲, 我們認為是可以解釋 的:外界刺激殺傷微生物時, 早期微生物自身免疫機制發揮 作用, 產生 NO , 這時的 NO 對于微生物是有保護作用的[ 14] , 而藥物大量長時間刺激誘使微生物產生大量 NO, 這時的 NO 又是有殺傷作用的。 所以我們認為 NO 產生的時間、環境、 濃度不同是它表現為雙刃劍作用的重要原因。 但這只是我 們的猜測, 其中的機制需要進一步的研究。 目前關于微生物 內源性 NO 的研究報道并不多見, 內源性 NO 在微生物的生 長過程中發揮著怎樣的作用尚不得而知。 但我們相信, 就像 在哺乳動物體內的作用一樣, NO 在微生物信號轉導等方面 也發揮著獨特的作用, 而且這種作用深受濃度、環境、菌種等 的影響。

對微生物來說, NO 是一把雙刃劍, 在適宜的環境中 NO 對微生物起到保護作用, 而條件不適則有可能對其造成殺 傷。 更加深入地研究 NO 對微生物生長造成的影響及其機 制, 必將有利于我們尋找新的抗感染藥物作用靶點和新的抗 感染治療手段。