導讀

異養細菌（HB）普遍存在于厭氧氨氧化工藝中，但其在部分硝化-厭氧氨氧化（PN/A）工藝處理高有機物廢水中的功能和生態作用仍未清楚。本研究旨在闡明單級PN/A處理熱水解工藝（THP）-厭氧消化（AD）廢水中的HB活性及其微生物相互作用。PN/A反應器實現了令人滿意的氮去除率，高達0.58±0.06 g N/(L·d)，同時THP-AD廢水中的COD去除率約12%。PN/A反應器的N2O排放因子為1.15%±0.18%（處理合成廢水）和0.95%±0.06%（處理消化液）。在反應器運行過程中，HB和功能微生物（即厭氧氨氧化細菌和好氧氨氧化細菌）之間保持著平衡的共生關系。Anaerolineae spp.的相對豐度明顯增加，而反硝化菌Denitratisoma在處理THP-AD廢水時略有減少。異養生物對電子供體的偏好解釋了增長趨勢的差異。

實驗設計與方法

結果與討論

1 PN/A工藝性能1.1反應器性能

PN/A反應器已在穩定脫氮性能下運行170多天（表1）。由于接種厭氧氨氧化顆粒污泥中的AOB豐度低，因此在啟動階段I時優化曝氣和進水NH4+方案以刺激AOB的生長。間歇曝氣是PN/A運行期間有效的曝氣策略，本研究中通過定期打開和關閉空氣供應來采用（表1）。進水NH4+濃度在63天內從124增加到243 mgN/L，而亞硝酸鹽僅在前30天供應。運行60天后，出水NH4+濃度低于2 mgN/L（圖1，A），實現了有效的NH4+去除，表明PN/A工藝完成。NO3-生成與總脫氮比（ΔNO3-/ΔTN）反映了該工藝的生物氮轉化，僅考慮AOB和AnAOB活性的情況下，理論ΔNO3-/ΔTN為0.13。在第一階段，ΔNO3-/ΔTN比值在0.15~0.48的范圍內變化，高于理論值，表明可能有亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）產生NO3-。隨著NLR的降低，NRR從前32天（有亞硝酸鹽供應）的0.94±0.39 gN/(L·d)下降到第52~63天（無亞硝酸鹽供應）的0.53±0.08 gN/(L·d)（圖1，B）。

在第二階段（處理RW），進水從SW變為THP-AD廢水。進水COD濃度為547±16 mgCOD/L，COD/NH4+-N比率為2.2±0.1。出水COD濃度為484±52 mgCOD/L，COD去除率約為12%。COD去除率相對低于以往研究（兩階段PN/A系統實現了50.4%到80%的高COD去除率，而PN反應器去除了53%到66%的COD。可能的解釋可能為：（1）與之前的兩階段PN/A系統的PN反應器（0.8~2 mgDO/L）相比，本研究中的DO（<0.05 mg/L）較低，好氧階段的氧氣限制導致COD氧化效果較差。（2）與之前的研究相比，THP-AD廢水中有機物的生物降解性較低。有機物的可生物降解性高度決定了于厭氧消化效率和穩定性，因此不同污水源的有機物特性不同是合理的。從第74天到第101天，出水NO2-濃度保持相對較低。同時，出水NO3-顯著減少，導致ΔNO3-/ΔTN比I期低0.16。RW處理期間，體系實現了令人滿意的NRR（0.58±0.06 gN/(L·d)），與之前實驗室規模和中試規模的研究相當。

由于從第103天開始出現NO2-積累，在第三階段（后RW處理）將進水改為合成廢水。此后，NO2-積累從第132天開始消失。ΔNO3-/ΔTN比值下降到0.09，NRR大大增加到0.91 gN/(L·d)。亞硝酸鹽積累表明NO2-生成率（主要由AOB完成）高于NO2-消耗率（主要由AnAOB完成）。盡管有報道稱廢水中不溶性有機物能對AOB產生抑制，但當注入THD-AD廢水時，AOB仍然保持活性。如前所述，在進水切換回合成廢水后，亞硝酸鹽積累消失，這表明THP-AD廢水可能抑制了AnAOB活性。

表1操作條件和反應器性能總結。

a R air on:反應期間供應空氣的時間百分比。

圖1 PN/A反應器性能。A：進水和出水中的含氮物質。B：氮負荷和氮去除。C：Rair on（反應期間供應空氣的時間百分比）和DO。

1.2細菌活性

為確定PN/A污泥在不同運行階段的細菌氮轉化活性，在反應器運行期間進行了批量實驗測試厭氧氨氧化活性。在第一階段取樣的污泥顯示出高厭氧氨氧化活性（SAA=851±8 mgN/(gVSS·d)）。在第二階段，合成廢水中的SAA降至504±6 mgN/(gVSS·d)，THP-AD廢水中的SAA降至501±55 mgN/(gVSS·d)（圖2）。在第三階段，將進水改回合成廢水后，SAA恢復到558.3 mgN/(gVSS·d)。厭氧氨氧化活性的演變表明，THP-AD廢水可能會阻礙厭氧氨氧化活性。同樣，之前的一項研究表明，THP-AD中的可溶性有機物（尤其是不可生物降解部分），直接抑制了AnAOB活性。

圖2 AnAOB的特定細菌活性和異養反硝化作用。PI：第一期；PII：第二期；PIII：第三期；SW：合成廢水；RW：消化液。

2 PN/A工藝的N2O排放概況

在合成廢水處理（I期）和RW處理（II期）期間監測氮形態和N2O分布（圖3）。雖然曝氣階段的空氣流速為2 L/min，但觀察到的DO較低（0.03 mgO2/L）；在非曝氣階段，DO降至0.01 mgO2/L。循環開始時的NO2-濃度為2.8 mgN/L，最大NO2-為13.6 mgN/L。N2O濃度響應于曝氣條件（圖3，C）。在曝氣階段，N2O濃度因剝離而逐漸降低，而在非曝氣階段，N2O濃度逐漸增加。在I期，PN/A反應器的比凈N2O產率為1.9±0.2 mgN2O-N/(gVSS·d)，N2O排放因子（ΔN2O/ΔNH4+）為1.15%±0.18%。第二階段氮形態顯示出與第一階段相似的模式，COD在整個循環中從544 mg/L下降到456 mg/L（圖3，B）。DO大部分時間都保持在0.05 mg/L以下，而在最后一個曝氣階段，由于NH4+耗盡，DO增加到超過1 mg/L的水平。當反應器加入THP-AD廢水時，N2O排放因子為0.95%±0.06%，略低于合成廢水。

本研究的N2O排放因子（0.88~1.31%）與之前對不添加COD的一階段PN/A工藝處理合成廢水的研究和處理廢水（1.2%~2%的進水TN）相當。PN/A工藝中N2O產生的來源主要包括：（1）異養反硝化菌的異養反硝化作用；（2）AOB硝化作用；（3）AOB的硝化反硝化作用。唯一的生物N2O消耗途徑是異養反硝化菌的異養N2O還原。對于不添加COD的PN/A工藝，AOB被認為是N2O的主要生產者；而與AOB相比，HB在N2O產生中的作用似乎微不足道。相比之下，以往的研究表明，在存在可生物降解有機物時，異養N2O生產為普遍途徑。因此，AOB可能是用合成廢水供給時PN/A反應器中N2O的主要生產者，異養N2O途徑可能在處理RW時得到促進。我們的結果表明，RW中的N2O排放量略低于合成水，因為異養N2O途徑受到THP-AD廢水的影響。Zhu和Chen（2011）報道了污泥RW降低了好氧-缺氧反應器的N2O和NO排放，推測污泥廢水中的Cu2+和丙酸增加了N2O還原酶活性與NO還原酶活性的比率，導致N2O排放量減少。同時，廢水中的有機物可能會改變異養N2O生成和消耗途徑的平衡。據報道，廢水的低COD/N（0.4）增加了硝化反應器中N2O的生成，而充足的有機物供應減少了好氧-缺氧反應器和PN/A反應器中N2O的排放。因此，異養N2O途徑受THP-AD廢水組分的影響。

圖3 SBR循環過程中PN/A反應器的氮形式和N2O排放分布。A、C：處理合成廢水。B、D：處理THP-AD廢水。

3 PN/A反應器微生物群落演替

從反應器運行周期和粒徑等角度分析了微生物群落組成。16S rRNA測序平均每個樣本產生了49,383個讀取，序列聚類后產生1381個OTU，相似度為97%。通過在至少3個樣本中設置高于5的OTU序列來過濾低豐度OTU。過濾后，剩余486個OTU用于進一步分析。在門水平上，綠藻門、變形菌門、擬桿菌門、浮游菌門和酸桿菌門為優勢門。在屬水平上，優勢屬包括c_Anaerolineae_1、f_Saprospiraceae_1、不動桿菌屬、o_Kapabacteriales、Nitrosomonas、Denitratisoma和Candidatus Jettenia（混合污泥，圖4，A）。Nitrosomonas spp.（唯一確定的AOB物種）的相對豐度隨著反應器的運行而增加，其在接種物中的相對豐度相當低（0.7%），但在第166天達到3.2%（混合污泥，圖4，A）。正如其好氧代謝所預期的那樣，Nitrosomonas spp.在絮狀污泥（直徑<200μm）的豐度高于顆粒污泥（直徑>200μm）（圖4，B）。另一方面，Nitrospira spp.（NOB）的相對豐度保持在1%以下。因此，通過應用間歇曝氣的方法，AOB在PN/A工藝中逐漸富集而沒有NOB富集。我們的結果與之前的研究一致，表明間歇曝氣是促進AOB生長和抑制NOB的有效方法。

Ca.Brocadia是接種物中的主要AnAOB物種（相對豐度7.8%），但在啟動階段和RW處理期后其相對豐度大大降低（低至0.1%）（混合污泥，圖4，A）。在后RW處理期間，Ca.Brocadia的相對豐度在第166天逐漸增加，達到8.8%。相比之下，另一種AnAOB Ca.Jettenia也存在于接種物中（相對豐度2.1%），其豐度在RW處理期間增加，然后在RW后處理期間保持相對穩定（混合污泥，相對豐度4.1%）。觀察到的Ca.Brocadia和Ca.Jettenia的差異增長趨勢與AnAOB的生態位分化理論一致，Ca.Brocadia spp.是通常在高底物環境中發現的r策略者，而Ca.Jettenia spp.是更好地適應底物限制環境的k策略者。接種物富含厭氧氨氧化的污泥適應進水中足夠的NH4+和NO2-，NLR高達3.5 gN/(L·d)，適合Ca.Brocadia生長。相反地，PN/A工藝受NO2-限制，因為NO2-的產生取決于好氧NH4+氧化速率。這種低底物條件有利于k-策略者Ca.Jettenia的生長。此外，與絮狀污泥中的Ca.Brocadia和Ca.Jettenia相比，顆粒污泥中二者豐度更高（圖4，B）。

HB在PN/A污泥中高度多樣化且含量豐富。Chloroflexi spp.在厭氧氨氧化工藝中廣泛被觀察到，其相對豐度從接種中的32±0%增加到RW處理期間的47±4%，然后在RW處理后進一步增加到54±8%。同時，c_Anaerolineae_1（隸屬于Chloroflexi門）從接種時期到RW處理期（混合污泥，圖4，A）的豐度由14±3%增加到24±6%，再進一步增加到33±8%。有趣的是，c_Anaerolineae_1在顆粒污泥中非常豐富（高達總群落的24%），而它們在絮狀物中的存在是有限的（低于總群落的7%）。變形菌屬也是普遍的種群，其相對豐度從接種物中的22±4%分別下降到RW處理期和后RW處理期的16±1%和15±2%。Denitratisoma隸屬于Proteobacteria，其豐度從接種物中的6±1%分別略微下降到RW處理和后RW處理后的4±1%和4±1%（混合污泥，圖4，A）。Limnobacter屬于Proteobacteria，其在反應器運行過程中也逐漸減少。Denitratisoma和Limnobacter在顆粒污泥中均顯示出更高的豐度（圖4，B）。

以THP-AD廢水作為進水，功能種群（AnAOB和AOB）不斷增長并保持活躍，而HB種群則顯示出不同的增長趨勢。雖然HB和功能性群體對底物存在競爭，但HB和AnAOB之間的代謝相互依賴，例如氨基酸營養共生、亞硝酸鹽循環或代謝物交換。功能菌群和HB可以在低濃度有機廢水中共存。先前在兩階段PN/A系統中處理COD/NH4+-N為0.97的廢水的研究表明，Ca.Kuenenia屬保持相對穩定，而Brocadiaceae spp.略有下降，Ottowia spp.和Denitratisoma spp.急劇增加。Zhang等人（2020）報道，進水中的低濃度富里酸（25~65 mg/L）促進了厭氧氨氧化反應器的NRR，而高濃度富里酸（>80 mg/L）抑制了反應器的性能。后續的微生物群落分析表明，Ca.Jettenia和Ca.Kuenenia也能高富里酸中存活下來。據推測，AnAOB和HB之間的代謝物交換可能有助于AnAOB在不利條件下生存。相比之下，HB可能在過量有機物存在的情況下強于功能菌群，導致工藝性能惡化。據報道，在具有過量易生物降解有機物和難生物降解有機物的厭氧氨氧化系統中，異養生物的逐漸生長，HB與AnAOB之間的競爭加劇。總之，包括含量、生物降解性和組成在內的有機物特征對微生物群落施加不同的選擇壓力，可以重塑功能種群與HB之間的關系。我們的結果表明，在處理THP-AD廢水時，功能種群和HB實現了平衡的共生并維持了穩定的脫氮性能。

通過PCoA分析進一步評估了反應器運行過程中微生物群落組成的演變。結果顯示來自相同運行時期的污泥樣品之間沒有存在明顯的聚類（圖4，C）。相比之下，基于污泥粒徑的樣品有明顯的分離（圖4，D）。絮狀污泥與顆粒污泥和混合污泥在PCoA 1方向上明顯分離（43.2%解釋度），Nitrosomonas europaea和f_Saprospiraceae對PCoA 1軸的貢獻最大。來自顆粒污泥和混合污泥的樣品沿PCoA 1軸緊密聚集（圖4，D）并沿PCoA 2軸分離。Ca.Jettenia和Thermomicrobiales主要貢獻于PCoA 2軸。這些結果表明，與絮狀污泥相比，顆粒污泥與混合污泥具有更多的相似性。

圖4 PN/A反應器的微生物群落分析。A：混合污泥中微生物群落最豐富的20個屬；B：絮狀污泥（直徑<200μm）和顆粒污泥（直徑>200μm）中20個最豐富屬的豐度。C：按運行期分組的微生物群落的PCoA分析。D：按顆粒大小分組的微生物群落的PCoA分析。

4 PN/A工藝的代謝潛力

微生物群落的功能由PICRUTs 2預測，并由KEGG數據庫注釋。根據注釋結果，碳水化合物代謝、輔因子和維生素的代謝以及能量代謝是主要的預測途徑。此外，翻譯、膜轉運、細胞生長和死亡途徑豐度較高。在PN/A反應器運行期間，未檢測到微生物代謝的明顯變化。在微生物氮轉化潛力方面，發現了負責反硝化、硝化、硝酸鹽同化、異化硝酸鹽還原成銨（DNRA）的基因（圖5，A）。至于硝化潛力，hao基因在反應器運行過程中逐漸富集并在第100天達到峰值，這與PN/A反應器的好氧NH4+氧化能力增強一致。微生物群落顯示出高反硝化潛力，群落中編碼了完全反硝化途徑（NO3-→NO2-→NO→N2O→N2）。編碼硝酸還原酶（nar）的基因顯示出高豐度，其次是編碼亞硝酸還原酶（nir）、NO還原酶（nor）和N2O還原酶（nos）的基因。總體而言，運行期間反硝化潛力相對穩定。DNRA潛力不容忽視，可能有助于系統氮轉化（圖5，A）。

研究檢測了40個最豐富的OTU的氮轉化能力，其中15個OTU編碼氮轉化基因（圖5，B）。Nitrosomonas-AOB編碼amo和hao，顯示完整的NH4+到NO2-途徑。Ca.Jettenia-AnAOB編碼hao和nar。許多編碼nar的OTU，隸屬于Denitratisoma、Limnobacter和f_Commonadaceae，表明它們具有將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的能力。值得注意的是，Denitratisoma編碼nar、nirD和nor，能夠將NO3-還原為N2O，這意味著Denitratisoma spp.是N2O生產者，這在之前的研究中也有記載，表明Denitratisoma oestradiolicum可能有助于厭氧氨氧化反應器中的N2O生產。注釋為o_Thermomicrobiales_1的高度豐富OTU編碼了nirK，它也可能是N2O生產者。同時，o_Ignavibacteriales、g_Ignavibacterium和f_Saprospiraceae編碼nos，可能將N2O還原為N2。值得注意的是，根據PICRUTs 2的基因功能預測，豐富的異養細菌Anaerolineae沒有編碼任何氮轉化基因。相反，之前的一項研究基于宏基因組學方法發現厭氧氨氧化顆粒污泥（本研究接種物）中的Anaerolineae編碼包括nar和nir的反硝化基因。與此相同，許多研究報告稱，Anaerolineae編碼反硝化基因并可以進行DNRA過程。因此可見，基于16S rRNA擴增子測序的功能預測可能不完整，導致Anaerolineae spp.的氮轉化基因在預測中缺失。

Denitratisoma spp.是微生物群落中豐富且潛在的重要反硝化菌，盡管其豐度在THP-AD廢水運行期間略有下降。另一方面，Anaerolineae的豐度則隨著反應器的運行顯著增加。這種差異可能是由HB對THP-AD廢水中有機物的適應引起的。在厭氧氨氧化工藝中已發現異養生物能利用細胞裂解、腐爛和可溶性微生物代謝物等來源的惰性有機物作為碳源。Denitratisoma的存在于厭氧氨氧化工藝中得到普遍鑒定，根據其棲息地的營養狀況，可將其劃分為兼性化學無機營養或化學有機營養細菌。

Denitratisoma能使用的電子供體包含易生物降解的有機物（如VFA）和難以生物降解的物質（如對二甲苯和雌酮），其電子受體可以是硝酸鹽和氧。研究表明，兩階段PN/A工藝去除了進水中的含氧有機化合物、蛋白質和腐殖質，厭氧氨氧化反應器中反硝化菌Denitratisoma的豐度增加。因此，Denitratisoma可以通過使用可生物降解的有機物來適應RW水質。Anaerolineae spp.隸屬于Chloroflexi，是能夠與DNRA結合進行碳水化合物發酵的細絲細菌。Anaerolineae spp.在厭氧氨氧化工藝中表現出非凡的適應性。據報道，在處理THP-AD廢水、添加葡萄糖的合成廢水和生活污水的厭氧氨氧化反應器中，Anaerolineae spp.豐度增加。發酵厭氧菌主要依賴于大分子有機物生長。因此，據報道，在厭氧氨氧化工藝中發現的Chloroflexi spp.能編碼和表達一系列細胞外蛋白酶、淀粉酶和細胞外肽和氨基酸的轉運蛋白。因此，Anaerolineae可能具有在THP-AD廢水中利用有機物生長的優越能力。HB對電子供體的偏好可以解釋微生物種群的差異增長趨勢。這項研究還表明Anaerolineae很好地適應了廢水，原因可能是其受益于惰性有機物質。

圖5 PICRUSt 2預測的微生物群落功能。A：參與氮轉化的基因。B：基于PICRUSt預測的由高豐度OTU編碼的氮轉化基因。藍色表示OTUs編碼了相應的基因，淺灰色表示OTUs沒有編碼相應基因。

結論

PN/A工藝在處理THP-AD廢水時實現了0.58±0.06 gN/(L·d)的NRR。盡管THP-AD廢水含有高COD濃度，但由于可生物降解的有機物供應有限，THP-AD廢水中的異養反硝化作用可以忽略。THP-AD廢水可能會影響異養N2O途徑。功能微生物（AnAOB和AOB）在反應器運行期間保持活躍并不斷增長。Anaerolineae在微生物群落中占主導地位，并在THP-AD廢水處理期間增加，而反硝化細菌Denitratisoma略有減少。總體而言，HB和功能微生物的平衡共生確保了工藝性能的穩定性。