微電極制備、表面修飾及活體／單細胞電分析應用

趙旭 王克青 李博 李長青 林雨青 （首都師范大學化學系北京１０００４８）

摘要

微電極是指至少在一維尺度上不大于２５μｍ的電極。微電極由于尺寸小而具有一些常規電極無法比擬的性質，如具有電流密度高、響應速度快、歐姆壓降（ｉＲ降）小、信噪比高等特點。微電極特殊的性質使其在電化學測試中具有獨特的優點和重要性，并在分析化學、生物學及醫學等方面得到了廣泛應用，尤其在生命分析領域如在單細胞檢測和活體分析中具有眾多重要的應用。微電極的設計制備是微電極電化學發展應用的關鍵，目前涌現出的制備微電極的技術有電化學刻蝕法、電沉積法、自組裝技術、化學鍍層技術等，這些制備方法為快速制備微電極提供了可能性。本文綜述了近年來微電極的研究進展，包括微電極的特點、分類、制備方法及其單細胞檢測和活體分析方面的應用，最后提出了微電極面臨的挑戰與發展方向。

１引言

在電化學的研究中常見的電極尺寸是毫米級別，由于其尺寸比較大，限制了其在一些領域的應用。為了滿足小空間中如活體、細胞的電化學分析應用需求，微電極應運而生。一般來說，微電極是指至少在一維尺度上不大于２５μｍ的電極［１］，其尺寸小于擴散層厚度。目前，微電極是電化學研究中興起較晚，也正蓬勃發展的一個領域。微電極有利于實現檢測裝置的集成便攜化，同時能夠在介電常數較低的有機溶劑中檢測電化學活性物質，近年來受到廣泛的關注［２］。微電極具有常規電極無法比擬的性質，例如電流密度高［３］、響應快速、ｉＲ降小、信噪比高、傳質速度快、易達到穩態等，這些優勢使其在很多方面的快速、高靈敏檢測成為可能。從１９６０年開始人們發現超微電極具有優良的電化學特性。在神經化學領域研究中，Ａｄａｍｓ和他的同事研究了一些生物胺類在微電極上的氧化過程及檢測方法［４］。在此基礎上，Ａｄａｍｓ［５］將碳糊電極植入到麻醉的鼠腦中，證明了傳統的伏安技術能夠成功應用到生物組織分析，同樣證明神經遞質能夠從突觸間隙的空間擴散到電極表面。與此同時，Ｗｉｇｈｔｍａｎ等［６］發現微電極在伏安技術方面具有比常規電極更為優越的某些特性，展示了微電極在電化學及電分析化學領域中具有良好的應用前景，從而引起了有關研究人員的廣泛興趣。目前，微電極的研究成為電化學的前沿領域，為研究者們探索物質的微觀結構、電化學性質和電化學過程提供了一種強有力的手段，并在生命環境分析領域具有重要應用。制備微電極的方法多種多樣，有電沉積法［７］、電化學刻蝕法［８］、激光拉制法和內部填充法等。近年來，隨著科學技術的發展，在制備微電極方法上涌現出很多新的技術，如自組裝技術［３］、化學氣相沉積、模板法、離子束刻蝕技術［３］、絲網印刷術［９］、紫外光照射化學鍍層技術［１０］等，這些制備方法為快速、高效制備微電極提供了新的思路。微電極在生命分析領域中的細胞檢測、活體生物原位分析等方面具有廣泛應用［１１～１４］。在微電極表面進行修飾之后可以用來實現高選擇性和高靈敏檢測細胞和活體中神經遞質類物質的含量以及體內一些關鍵信號分子，如ＮＯ，ＣＯ等［１５］。微電極還可以應用在毛細管電泳?電化學檢測系統［１６］，作為掃描離子電導顯微鏡和掃描電化學顯微鏡的探針［１７，１８］，研究電化學反應的動力學參數［１９，２０］，環境分析中檢測水中重金屬離子［２１］，檢驗食品新鮮程度［２２］和電位型活體細胞傳感等方面［２３～２６］?？傊㈦姌O可以廣泛應用于活體分析、生物傳感、生物細胞檢測、掃描探針顯微鏡領域、毛細管電泳?電化學檢測系統、生命科學、食品學和環境分析與監測等各個領域。

基于微電極的高靈敏、高時空分辨檢測神經化學物質的分析方法有助于追蹤神經系統中活性物質如能量代謝物質、神經遞質及其代謝產物、ＮＯ等小分子動態釋放，進而有助于理解中樞神經系統障礙或疾病產生的分子機制。根據微電極在生命分析領域中的重要意義，本文綜述了近年來微電極的研究進展，包括微電極的特點、分類、制備方法以及在單細胞、活體等方面的最新應用研究。

２微電極的特點

由于微電極的電極尺寸達到微米級，因此具有常規電極無法比擬的電極特性。

２.１電流密度高在一定電壓下，微電極能夠產生電化學響應信號。半徑很小的電極以非線性擴散中的徑向擴散為主，由于電極尺寸小，所得擴散電流在短時間內即能達到穩態［２７］。研究結果表明當電流達到穩態時，電流的密度與電極半徑成反比，因此，微電極具有很高的電流密度［７］。

２.２ｉＲ降小

在電解池中存在電極自身的電阻和電極表面附近溶液層的電阻，從而會產生ｉＲ降。而在微電極上產生的極化電流數量級一般在１０－９Ａ左右，甚至可達到１０－１２Ａ，因此ｉＲ降小。

２.３信噪比高

充電電流ｉｃ與時間ｔ的關系如下式表示：

ｉｃ＝ΔＥＲｅｘｐ（－ｔＲＣ）（１）

式中，ΔＥ為階躍電位的幅度，Ｒ為電解池內阻，ｔ為階躍電位持續時間，Ｃ為雙電層電容［２８］。電極／溶液界面的電容Ｃ∝ｒ２０，而溶液的阻抗Ｒ∝１／ｒ０，因此，時間常數ＲＣ∝ｒ０。ｒ０減小使微電極的時間常數ＲＣ降低，充電電流ｉｃ的衰減速率變得更快，因而增加信噪比，可提高測定的靈敏度。相比之下，常規電極的尺寸大，導致信噪比降低，并不適合于快速的電化學反應研究［２９］。

２.４傳質速度快且易達到穩態

超微圓盤電極的擴散傳質速率Ｍ可以用式２［３０］表示：

Ｍ＝４Ｄ／（πｒ）（２）

Ｄ為擴散系數，ｒ為電極半徑。ｒ越小，擴散速率越快。與此同時，當電極表面傳質速率快時，反應物向電極表面傳輸的過程中不受干擾。因此，可使用微電極研究速率較快的電化學反應［２８］?；谏鲜鑫㈦姌O傳質規律可得到微電極的穩態擴散電流，公式如下：

ｉ＝４πｎＦＤｃｏｘｒ０（３）

式中，電流為穩態電流，與氧化態物質在溶液中的濃度（ｃｏｘ），擴散系數（Ｄ），電極半徑（ｒ０）有關［２８］。另外，微電極的循環伏安圖呈現典型的Ｓ形，而不出現常規電極所形成的峰形。

２.５簡化測量裝置

在常規電極的伏安實驗中，為了達到體系的穩定，常采用三電極體系進行測量。而在微電極的體系中，對電極比微電極的面積大１０４～１０５倍，對電極上電流密度極低、基本不發生極化，因此，參比電極可同時作為對電極來使用，即在微電極體系中采用二電極體系，從而簡化實驗裝置。

２.６存在的不足

因為微電極尺寸小，所以制備難度大，成本較高，成功率和重現性也是一大難題。通過微電極的電流很小，電流大小達到ｎＡ甚至ｐＡ級別，所以檢測系統應具有更高的信號檢測靈敏度。另一方面，由于微電極體系電流信號小，受到環境干擾大，因此，對實驗條件的要求比常規電極體系高。目前，加工技術越來越精細，電子技術也有所提高，針對以上這些問題，得到了較好的解決策略。

３微電極的類別與制備方法

按照不同的電極制作材料，伏安法或者安培法用的微電極主要分為非金屬微電極和貴金屬微電極兩類。非金屬微電極中多以碳超微電極、碳纖維微電極［５］和碳納米管功能化微電極為主；在貴金屬微電極中，鉑微電極和金微電極［２９］最為廣泛。最常用的電極材料中，碳纖維微電極電勢窗口寬，多應用于水溶液體系的電分析。與貴金屬微電極相比，碳纖維微電極雙電層電容大、背景電流高，因而在檢測中信噪比較低［３１，３２］。根據微電極的形狀特點，微電極包含微盤電極、微圓盤電極和微環電極等［２９］。按照電極的尺寸大小，可將電極分為微電極（１００ｎｍ～２５μｍ）［１］、超微電極（１００ｎｍ～１μｍ）和納米電極（＜１００ｎｍ）［３３］。

微電極具有諸多優異性能，越來越多的研究者對微電極產生了濃厚的興趣。制備微電極的傳統方法中多以電沉積法［７］和電化學刻蝕法［８］為主。電沉積法即為在基底上沉積電極材料或包覆層［７］。通過電沉積法制備微電極的幾何形態主要呈現圓錐形、半球形、球形。最近，Ｚｈａｎｇ等［３４］基于電沉積法制備不同金屬材料的電極，如金、鉑、銀和銅微電極，其電極尺寸小于１００ｎｍ，對比之前的制備方法，利用該制備方法可控制電極尺寸大小。電化學刻蝕法多以制備半球型微電極為主，如Ｐｅｎｎｅｒ小組［８］使用電化學刻蝕法制備尖端尺寸為１ｎｍ左右的電極。具體操作過程如下：首先，在一定的電位下將放置在溶液中的金屬絲進行電化學刻蝕之后，可得到錐形的納米尖端。尖端表面填涂電泳漆、熔融玻璃、環氧ＡＢ膠等絕緣物質之后，即可制備出半球型微電極。電化學刻蝕法成本低、儀器簡單、重現性好，經過多次絕緣之后方可得到尺寸更小的微電極，因此制備過程較為繁瑣。目前，還有一些制備微電極的技術，如自組裝技術、離子束刻蝕技術［３］、絲網印刷術［９］、化學鍍層技術［１０］等，這些都是快速制備微電極的方法。

３.１碳超微電極

在非金屬微電極中，碳超微電極由于其尺寸易于調控，應用廣泛，因而引起有關研究人員的廣泛興趣。Ｕｎｗｉｎ課題組［１８］將石英毛細管拉制呈尖銳的納米尖端，外壁熱解丁烷沉積碳形成柱狀電極，其電極尺寸易于調控。該方法簡單、快速，得到的電極尺寸相對較小且靈敏度高，可應用于掃描電化學顯微鏡的探針。隨后，該課題組［３５］制備了一種半徑在５～２００ｎｍ的圓盤狀碳納米電極。將石英毛細管拉制呈尖銳的納米尖端，使用從上至下的方法制備碳納米電極，在其尖端高溫熱解后沉積碳，制成內徑在５～２００ｎｍ的碳超微圓盤電極，這種電極由于尺寸易于調控，可用于單細胞檢測。在此電極上沉積鉑后可用來監控腦片外部和內部中的耗氧量。另外，這些納米電極可以作為掃描離子電導顯微鏡的探針［１７］，使得活細胞中的成像具有很高的分辨率。

本課題組［３６］通過將中空的多根石英毛細管纏繞拉制形成微電極陣列支撐體，然后通過熱裂解乙炔將碳沉積于石英管內壁形成碳的微環狀電極，構筑了尖端為１０～５０μｍ、數目可達１５個微電極的陣列，應用一個含有８個微電極的微電極陣列可進行單個嗜鉻細胞瘤細胞胞吐過程中不同位點釋放的電化學成像研究，初步檢測到亞細胞層次的胞吐空間分布不均勻性。這一方法為單個可尋址微電極陣列的制備提供了一個全新的思路，為高通量活體分析奠定了堅實的平臺基礎。

３.２碳納米管微電極

碳納米管微電極具有高機械強度、高長徑比、良好的導電性等特點使得碳納米管已經廣泛應用到不同的電化學檢測中［３７，３８］。研究表明［３９］，碳納米管修飾碳纖維微電極用于神經遞質檢測時，該電極上電子轉移的動力學得到提高并且對有吸附作用的物質的靈敏度有所提高（如多巴胺），而且電極不易受普通生物物質的影響，例如５?羥吲哚乙酸。此外，將碳納米管固定在碳纖維微電極上，并將此電極浸泡在碳納米管?全氟磺酸的懸浮液中首次制備出了碳納米管微電極［３９］。不過，此方法重現性較低。進一步的工作證明單壁碳納米管化學自組裝是在碳纖維圓盤電極上形成均勻排列的碳納米管層的一種有效方法［４０］。體內和體外的實驗證明碳納米管修飾的電極檢測多巴胺時靈敏度可提高３６倍。

３.３碳纖維微電極

碳纖維微電極的傳統制備方法是將碳纖維插入到絕緣性能良好的玻璃或者石英毛細管內，高溫拉制成兩個具有尖端的電極，利用環氧液滴對尖端進行密封，并暴露出尖端碳纖維，對尾端碳纖維用導線連通，即可成功制備。該微電極直徑（１００～６００μｍ）較小。因此，它在植入過程中對組織損傷很小，使其得到廣泛的應用［５］。Ｔｉａｎ課題組［３２］第一次在碳纖維微電極上電沉積金納米粒子進而檢測超氧根離子，該檢測方法具有一定的選擇性、靈敏性和穩定性。另外，由于碳纖維微電極的生物相容性好有利于增強活體中超氧根離子的響應信號。Ｍａｏ課題組［４１］制備碳纖維微電極在活體中選擇性檢測氧氣，在碳纖維表面高溫熱解酞菁鐵然后電沉積上鉑納米粒子，此電極展現出快速的動力學過程，氧氣通過四電子轉移過程發生還原反應而不形成過氧化氫。這項研究提供一種新穎、可靠的制備方法，用于高靈敏、高選擇性地監控在不同生理過程中體內的氧氣含量，微電極可用于活體測定氧氣含量。

３.４鉑微電極

在貴金屬微電極中，常使用到的是鉑微電極或者金微電極。Ｂａｒｄ小組［４２］已經運用電沉積法制備Ｈｇ／Ｐｔ半球電極。Ｃｈｅｎ等［４３］通過電沉積方式使得金納米粒子整齊地包被在鉑盤表面，進而制備出鉑微電極，從而實現紋狀體中多巴胺含量的檢測，響應時間短（＜２ｓ），靈敏度提高了２.６倍。Ｚｈａｎｇ等［４４］將直徑為２５μｍ的鉑線通過拉制、密封、刻蝕等操作成功制備了鉑微圓盤電極。另外，該課題組［４５］還在較低的陽極電位下，快速地制備出覆蓋有薄層氧化鉑的微電極。Ｕｍｅｄａ等［４６］將直徑為５０μｍ的鉑線進行高溫熱封、拋光和覆蓋一層全氟磺酸膜操作之后，制備出鉑微圓盤電極用于檢測氧還原反應（ＯＲＲ）中產生的過氧化氫總量。Ｌｅｅ課題組［１５］將鉑線熱封在已經拉制好的玻璃毛細管里，在氯化鈣溶液里進行刻蝕操作，之后電沉積上鉑黑形成鉑微圓盤電極用于檢測一氧化氮含量。因此，將鉑絲進行拉制、密封、刻蝕、修飾等操作之后，鉑微電極即可制備而成。

３.５金微電極

金微電極的制備主要是通過在絕緣條件下埋藏一根金導線，并用絕緣材料密封。隨后通過電化學的刻蝕［４７］、拋光［４８］、激光拉制［４９］的方法制備成微米大小的微電極。Ｍｉｒｋｉｎ課題組［４９］通過激光拉制器減小電極尺寸，他們制備的金微電極直徑為４０ｎｍ。到目前為止，涌現出許多制備金微電極的方法，主要包括電沉積法、自組裝技術和化學鍍層技術。

ＤｉＬｏｒｅｎｚｏ［５０］報道了一種快速、簡單、高效的電沉積方法制備金微電極，即在０.１ＭＨＡｕＣｌ４和１ＭＮＨ４Ｃｌ溶液中使用簡單的電沉積方法，將該電極用于葡萄糖的檢測。Ｂａｒｄ等［２０］報道了基于金納米顆粒的自組裝功能（金納米顆粒通過二硫鍵實現自組裝），通過自組裝技術成功制備金球形電極。其制備過程簡單，首先向拉制好的毛細管尖端空腔內注入１，９－壬二硫醇，然后把尖端浸入金納米顆粒溶膠中，最后調節毛細管尖端大小，即可得到直徑為１～３０μｍ的球形電極。該方法反應溫和且成本低廉。

本課題組［１２］采用無毒聚多巴胺多功能材料代替常用的（３?氨基丙基）?三乙氧基硅烷，發展了一種新穎、簡便、快速的化學鍍層技術自下而上制備金環微電極的方法。如圖１所示，此金環微電極制備過程為在毛細管內壁羥基化，毛細管內壁自組裝上聚多巴胺層，鹽酸羥胺還原氯金酸形成金納米粒子，促使金納米粒子生長并形成金膜。最終制備而得的金環微電極頂端最小直徑達到１０μｍ，可控制的金膜厚度達到２００ｎｍ～３μｍ。通過金納米粒子與巰基的自組裝可實現對活體中多巴胺的檢測。

Ｈｅ等［１０］提出一種制備金微電極的化學鍍層方法，主要是通過紫外照射的方法使得在聚苯乙烯板上沉積金納米粒子從而形成金微電極。如圖２所示，從低壓力汞燈發射的高能量的紫外光照在聚苯乙烯的表面上，使得在照射條件下產生光化學催化的羧基官能團進而與金納米粒子結合，最終通過化學鍍層技術形成金膜。通過在聚苯乙烯上形成金微膜，能夠準確控制電極尺寸，制造成本低廉。該電極具有良好的穩定性和優良的電化學性能，他們將此電極應用于多巴胺和兒茶酚胺含量的檢測和分離。

在多樣化微電極發展的基礎上，微電極陣列由于具有高時空分辨率，可以在同一時間從微小的空間如組織和細胞上記錄到更多的化學物質代謝變化過程，也引起研究者廣泛關注［４］。通過單獨控制每個電極的電位可以同時檢測到不同的分析物，或者可以記錄到單個細胞表面不同空間位點同一化學物質的釋放。

圖１金環微電極的制作步驟［１２］。（Ａ）拉制好的空玻璃毛細管；（Ｂ）毛細管內壁羥基化；（Ｃ）毛細管內壁自組裝上聚多巴胺層；（Ｄ）內壁生長金納米粒子；（Ｅ）形成金膜；（Ｆ）金環微電極尖端修飾３?巰基丙酸

圖２在聚苯乙烯薄片上制備電極的步驟圖解［１０］。（ａ）紫外照射；（ｂ）氨基；（ｃ）金納米粒子；（ｄ）金層

捕捉亞細胞水平的細胞胞吐的變化時，微電極陣列測量尺寸和電極間距必須小于細胞（一個神經元直徑約為４～１２０μｍ）直徑大小。通過將碳纖維插入到多管玻璃中制備出碳圓盤微電極陣列和在石英毛細管內熱解乙炔沉積碳，可分別形成７和１５個碳環微電極陣列［３６，５１］，用于檢測單細胞釋放的物質。研究人員還利用各種微制作的方法來制備可增加電極數量的微電極陣列。此類微電極陣列可應用在單細胞和細胞網絡中［５２，５３］。Ｗａｎｇ課題組［５２］報道了一種制備單個可尋址微電極陣列的方法，可用來檢測單個嗜鉻細胞瘤細胞釋放的神經遞質物質。他們發展了一種在鉑微電極陣列上修飾IV型膠原的方法，可以促進細胞黏附和生長。他們設計的新裝置包含３６個微電極，微孔大小為４０μｍ×４０μｍ，此裝置可直接將體外培養的腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞定位在傳感器的正上方。ＭｃＣａｒｔｙ等［５４］在三個凹槽里通過裂解、光刻等技術制備微電極陣列，制備方法重現性好，穩定性良好，該課題組將微電極陣列簡單地移植到體內中可實時記錄紋狀體中多巴胺的釋放信號。該課題組［５５］還報道了碳超微電極陣列的制備方法。裝置包括４～１６個通過熱解光致抗蝕劑制備而來的微電極，此裝置易受光刻控制，并且已經在性能方面類似于玻碳電極。Ｃａｉ課題組［５６］構筑了一種高靈敏的微電極陣列，并在微電極陣列上電沉積聚吡咯石墨烯，用于檢測嗜鉻細胞瘤細胞釋放的多巴胺含量。該檢測方法具有高靈敏性、特異性良好、檢出限低和響應快速等特點。

４微電極的活體／單細胞應用

由于微電極尺寸小、響應時間短、表面傳質速率快、對細胞或組織損傷小，可將微電極應用于生命科學領域，進行單細胞分析，測定生物體內活性物質，進而用來高靈敏、高時空分辨監測一些參與生理過程的小分子物質在神經系統中的動態釋放，以此研究中樞神經系統疾病發生前后的物質變化，為生理學和病理學研究提供指導。由此可以看出，使用微電極可實現對生物組織的實時、在線分析。本節詳細介紹微電極檢測神經化學活性物質（多巴胺、抗壞血酸、兒茶酚胺）以及小分子（過氧化氫、一氧化氮）。

４.１活體檢測

碳納米管修飾的碳纖維微電極應用于活體分析檢測中。Ｚｈａｎｇ等［１１］用一種新的電化學方法應用于活體腦中的抗壞血酸的檢測，如圖３所示?；谔技{米管的電化學性質有利于抗壞血酸進行氧化反應，可利用多層次的碳納米管修飾碳纖維微電極檢測抗壞血酸含量，相對于鼠腦中共同存在的其他電活性的物種具有較高的選擇性，例如３，４?二羥基苯乙酸、尿酸和５?羥基色胺。此電極具有高的選擇性和良好的重現性。因此，可以選擇性來檢測鼠腦中的抗壞血酸含量。

圖３循環伏安法測量紋狀體中抗壞血酸含量的實驗步驟［１１］。碳纖維微電極的掃描電子顯微鏡圖（Ａ）修飾多壁碳納米管之前；（Ｂ）修飾多壁碳納米管之后；比例尺為１μｍ

?ｚｅｌ團隊［５７］用殼聚糖修飾的碳纖維微電極對血清素進行選擇性檢測。圖４顯示沒有任何修飾的碳纖維微電極與殼聚糖修飾的碳纖維微電極在活體中檢測的對比。實驗表明用未修飾碳纖維微電極記錄的氧化峰包含了抗壞血酸和血清素的電化學信號，而殼聚糖包被的碳纖維微電極可排除抗壞血酸的干擾。與未修飾碳纖維微電極相比，包被殼聚糖的碳纖維微電極對血清素具有一定的選擇性和較高的靈敏度。使用該微傳感器可測量出低濃度的血清素，檢出限為１.６ｎＭ?；铙w中的結果表明，在高空間和時間的分辨率下，殼聚糖修飾的電極可檢測斑馬魚腸中血清素［５７］。

圖４未修飾的碳纖維微電極和殼聚糖包被的碳纖維微電極在活體檢測后的微分脈沖伏安圖［５７］

除了金屬材料微電極，貴金屬微電極在活體檢測中也具有非常重要的作用。本課題組［１２］通過濕沉積技術制備金環微電極，用３?巰基丙酸修飾的金環微電極可以實現實時監控活體鼠腦中兒茶酚胺的釋放，如圖５［１２］。

圖５３?巰基丙酸修飾的金環微電極記錄鼠腦紋狀體中兒茶酚胺的釋放量［１２］。（Ａ）在０.２Ｖ電壓下修飾３?巰基丙酸之前（黑線）和修飾３?巰基丙酸之后（紅線）檢測多巴胺的Ｉ?ｔ圖；（Ｂ）３?巰基丙酸修飾的金環微電極記錄鼠腦紋狀體中兒茶酚胺的釋放

Ｃｈｅｎ等［４３］使用金納米粒子和自組裝單分子層修飾鉑微電極監控帕金森疾病的動物模型中的多巴胺消耗量，結果表明，可提高檢測多巴胺的靈敏性和特異性，并且減小抗壞血酸的干擾。用此微電極檢測到多巴胺濃度線性范圍為０.０１～５μＭ，線性相關系數為０.９９。

Ｓｈｉ等［５８］制備出一種全氟磺酸修飾的覆蓋有金納米粒子的玻璃毛細管作為微電極并成功應用于鼠腦紋狀體中多巴胺的選擇性檢測，如圖６所示。

圖６全氟磺酸修飾金納米粒子玻璃毛細管實時檢測鼠腦中的多巴胺含量［５８］。通過注射２０ｍｇ·ｋｇ－１的氨苯甲異喹使鼠麻醉，使用全氟磺酸修飾金納米粒子玻璃毛細管實時監測鼠腦中多巴胺含量的Ｉ?ｔ圖。箭頭顯示氨苯甲異喹的注射時間

Ｂａｒｂｏｓａ等［５９］報道了一種包含４個鉑響應點的覆蓋葡萄糖氧化酶的微電極陣列傳感器，如圖７所示。該傳感器用于檢測鼠腦中葡萄糖含量，具有高選擇性、靈敏性和穩定性良好等特點。

圖７包含４個鉑響應點并覆蓋葡萄糖氧化酶的微電極陣列傳感器的示意圖［５９］

微電極還可以設計為電位型微型傳感器進行活體檢測研究。Ｍａｏ等［２３］基于碳纖維微電極制備了質子選擇性微電極監測鼠腦中ｐＨ值的變化。該電極是將含有增塑劑、氫離子載體和離子交換劑的聚氯乙烯聚合物基質修飾于碳纖維微電極。該微電極具有很高的抗蛋白質污染性能，能夠維持對ｐＨ值監測的靈敏性和可逆性，在范圍較小的ｐＨ值變化（６.０～８.０）中表現出很好的響應。此電極可以實時監控活體ｐＨ值變化過程。Ｇｏｄａ課題組［２４］設計了一種Ｉｒ／ＩｒＯｘ離子選擇性微電極，在其表面非特異性吸附牛血清蛋白后監測其電位響應。此電極在吸附蛋白質之后，在較寬的ｐＨ值范圍內依然具有一定的電位響應，并且對蛋白污染具有一定耐受性，可直接用于含有生物分子的實際樣品中的電位測量。

總之，通過在碳纖維微電極、金微電極、鉑微電極等微電極表面修飾多壁碳納米管、３?巰基丙酸、金屬納米粒子等物質之后，可以實現高靈敏、高選擇地檢測活體中的抗壞血酸、多巴胺等神經遞質類物質，檢出限低至ｎＭ級別，同時還可以應用于電位型傳感方面的研究。

４.２單細胞檢測

不管是非金屬微電極還是貴金屬微電極都可以用來實現單細胞檢測。Ｗｉｇｈｔｍａｎ和Ｅｗｉｎｇ等構筑了一種圓柱形碳纖維微電極［６０，６１］，可用于電化學定量分析檢測腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞和鼠腦組織中釋放的神經遞質物質。Ａｄａｍｓ等［６２］使用金納米粒子網狀形成的碳纖維微電極作為一種新的微電極傳感器，成功檢測出單細胞分泌的多巴胺。這種用來檢測大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞分泌的多巴胺新型微電極，如圖８所示。該微電極具有使用壽命長、穩定性良好等優點，并能顯著降低電極表面與多巴胺的聚合作用。更為重要的是，由于金納米粒子本身具有較強的惰性、弱的化學吸附作用、形成溶膠?凝膠網狀時的高度穩定性、以及納米粒子網狀獨特的３Ｄ結構等特殊性質，可大幅度提高傳感器的靈敏度。

圖８碳纖維微電極與金納米顆粒網狀電極檢測單細胞胞外釋放的多巴胺［６２］

本課題組［３６］報道了一種新型、簡便的方法來制備碳環微電極陣列。這類微電極陣列應用于單一嗜鉻細胞瘤胞外分泌多位點傳感時，可檢測出單一的神經元細胞或細胞網絡。其制備過程簡單、快速，如圖９所示。此外，還可調控陣列管中電極的數量，已報道出單一的陣列頂端可容納８～１５個電極。這些電極具有十分良好的電化學性能和重現性，使得其在單細胞分析檢測方面具有常規微電極無可比擬的優點。

圖９碳環微電極陣列用于細胞檢測［３６］

使用火焰刻蝕法制備微電極實現單細胞檢測也是當下的一個研究熱點。利用該方法制備出的微電極電化學活性面積較大，可直接插入到細胞里進行檢測［６３］。相比圓柱形的碳纖維微電極，這些電極具有更高的靈敏度，能顯著改善動力學參數并對神經遞質具有快速的響應［６４］。Ｅｗｉｎｇ等［１４］將具有納米尺寸尖端的碳纖維微電極直接應用于檢測腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞中分泌的兒茶酚胺量，如圖１０所示。對于細胞內的測量來說，尖端納米尺寸的圓錐形碳纖維微電極可以穿過細胞膜并對膜沒有損壞。

圖１０頂端納米尺寸的碳纖維微電極檢測單個腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞顯微鏡圖［１４］。（ａ）示意圖（橙色的小圓圈代表囊泡）；（ｂ）尖端為納米尺寸的圓錐形的碳纖維微電極檢測單個腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞顯微鏡圖

微電極作為電位型傳感還可以應用在單細胞檢測中，Ｎｇ等［２５］報道氧化銥微電極用于監測內皮細胞中急性、局部的ｐＨ值變化，可實時監測代謝反應，有助于實時監測細胞的相互作用。Ｔｈｕｎｄａｔ課題組［２６］制備了一種靈敏、生物相容性好的納米纖維電位型傳感器，可用于研究癌細胞的代謝活動，還可實時監測細胞外的ｐＨ值變化。同時，它可用于監測癌細胞的化學耐藥性，對未來發展新的抗癌藥物具有潛在意義。

微電極不僅能夠檢測生命系統中的神經遞質類物質，還能檢測一些生命體能量代謝物質和調質類小分子物質及自由基等。

基于鉑納米粒子對過氧化氫良好的電化學催化作用［６５］，Ｈｕａｎｇ等［１３］報道了一種金／鉑粒子混合納米結構自組裝的金微線微電極，發展了一種高靈敏度、高空間和高時間分辨率的傳感器應用于人類乳腺癌細胞內過氧化氫的檢測。電催化可還原過氧化氫，檢出限低至０.３ｎＭ。微電極超小的幾何尺寸、高靈敏度，能夠實時準確監控出乳腺癌細胞中過氧化氫的釋放，如圖１１所示?；谝陨咸攸c，微電極已經在生理學和病理學的應用方面展現出良好的發展前景。Ｚｈｅｎｇ等［６６］制備鈀納米粒子包被的碳納米管纖維微電極進而檢測過氧化氫含量，其檢測過程響應快速（２ｓ），檢出限低至２μＭ，該電極對過氧化氫的檢測具有高靈敏度和選擇性。Ｗａｎｇ等［６７］通過電沉積方法在碳纖維微電極上沉積鉑納米粒子制備出的電極，對于過氧化氫具有一定的催化能力，檢測范圍寬（０.０４４～１２.３０ｍＭ），進而可以檢測出細胞瘤釋放的過氧化氫含量。

圖１１金／鉑粒子混合納米結構的微電極檢測乳腺癌細胞釋放的過氧化氫Ｉ?ｔ曲線［１３］。（ａ）在丙二醇甲醚醋酸酯（ＰＭＡ）刺激下從６個ＭＣＦ?７細胞中釋放Ｈ２Ｏ２；（ｂ）從單個ＭＣＦ?７細胞中釋放Ｈ２Ｏ２；（ｃ）細胞與過氧化氫酶孵化之后在ＰＭＡ刺激之后ＭＣＦ?７細胞釋放過氧化氫；（ｄ）在磷酸緩沖鹽溶液刺激下ＭＣＦ?７細胞釋放過氧化氫

一氧化氮是神經、心血管系統細胞間進行信息傳遞的重要調節因子，作為第二信使和神經傳遞物質在生命體系中同樣發揮著重要的角色。發展一種快速并且具有一定靈敏性的傳感器在生物體中檢測一氧化氮具有十分重要的意義。目前，光學和電化學方法是檢測一氧化氮的兩種主要方法［６８～７０］。電化學傳感器具有檢出限低、響應快速、制備簡單、尺寸小等特點，并且在生物樣品中能夠實時監測一氧化氮的濃度［７１～７３］，因此，發展電化學傳感器來高效、靈敏地檢測一氧化氮引起了人們的廣泛興趣。

金屬納米材料具有較快的電子傳遞和一定催化效果等特點，被廣泛用來合成傳感器監測一氧化氮的釋放。目前，已經構筑出金納米粒子、鉑納米粒子類的傳感器來檢測一氧化氮。貴金屬具有優異的特性，近幾年來被廣泛應用在不同的領域［７４，７５］。其中，金屬納米材料具有較快的電子傳遞和催化效果等特點，被廣泛用來制備傳感器監測一氧化氮的釋放，例如已經構筑出金納米粒子［７６，７７］、鉑納米粒子［７８］類的傳感器來檢測一氧化氮。Ｈｕ等［７９］通過一種簡單的化學液相沉積法在石英纖維上生長金納米粒子薄膜，制備出了一種新型的金纖維微電極。通過電聚合上煙酰胺和全氟磺酸后，這種一氧化氮微傳感器靈敏度高、檢出限低至３.６ｎＭ，可成功用于檢測小鼠肝細胞中的一氧化氮的釋放。Ｈｅｎｒｙ等［８０］制備鉑微電極來檢測一氧化氮，進一步提高了電極抗污染能力，檢測限為９０ｎＭ～１μＭ。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等［８１］使用金納米粒子修飾的碳超微電極陣列，對一氧化氮的檢測具有一定的選擇性和靈敏度，并且此電極對于一氧化氮氧化具有一定的催化能力。

針對單細胞檢測，對于電極的尺寸和性能有更高要求，微電極可適用于單細胞物質檢測的諸多方面。相比貴金屬微電極，因其具有良好的生物相容性和較低的制作成本，碳纖維微電極更適用于單細胞檢測。此外，通過在貴金屬微電極表面修飾上納米粒子也可以實現低檢測限檢測過氧化氫、一氧化氮等小分子。

５結論

隨著電子技術的高速發展，制備出的微電極最小極限直徑在不斷減小。但是在實際生物樣品檢測過程中，微電極表面易發生吸附、鈍化等物理現象以及傳質過程引起的擴散、對流、電滲透等電化學現象，都會不同程度的影響檢測時的靈敏度和選擇性。另外，在電極表面修飾的某些材料會因時間推移而褪去，從而降低微電極的性能。關于實際檢測過程中碳纖維的降解是否會改變電極的響應；如何減小活體分析時微電極的植入對于組織造成的不可避免的損傷；活體檢測的復雜性及待測物質與干擾物質相互影響作用等問題仍然亟待解決［５］。

目前，微電極的發展更側重對微小尺度結構的研究［８２］，微電極的發展趨勢是制備出納米級別的電極，進而獨立發展成納米電子學學科［８３］。此外，可將成熟的金、鉑微電極的制備方法拓展到其他金屬材料上，以進一步開展新的微納傳感器應用研究。通過改進已有的制備技術，集成具有高通量分析性能的微電極陣列可同時檢測和分析多種組分。研究如何實現微電極的傳感器尺寸的納米化，并應用在單細胞與活體分析研究中，可以使得微傳感器呈現出更多的生物分析空間兼容性，從而在基礎生物學和醫療領域中發揮更大作用。另外，可以擴展微電極材料的范圍至更多功能性材料或者擴展成３Ｄ結構，實現微電極在更多的領域中發揮出最大的價值。