細(xì)胞電融合技術(shù)自發(fā)明以來，由于其可控性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、對(duì)細(xì)胞無毒害等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，逐漸成為現(xiàn)代生物工程技術(shù)中的一個(gè)重要工具，被廣泛應(yīng)用于雜交育種、單克隆抗體制備、藥物篩選等領(lǐng)域。隨著微流控技術(shù)和微加工技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞電融合芯片技術(shù)在最近十幾年發(fā)展尤為迅速。細(xì)胞電融合芯片技術(shù)除了具有傳統(tǒng)細(xì)胞電融合技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，還更精確高效、集成度高、便于實(shí)驗(yàn)觀察、樣本消耗少，因此在國(guó)內(nèi)外廣受關(guān)注。

本論文運(yùn)用現(xiàn)代微加工技術(shù)制作了基于微電極陣列的細(xì)胞電融合芯片，利用介電電泳效應(yīng)和細(xì)胞電穿孔原理實(shí)現(xiàn)細(xì)胞排隊(duì)和電融合。細(xì)胞排隊(duì)和電穿孔是電融合中兩個(gè)最重要的過程，本論文首先對(duì)它們的機(jī)制和模型進(jìn)行了深入探討。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用有限元方法分析了介電電泳效應(yīng)下細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)以及電極結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞跨膜電位分布的影響，并根據(jù)仿真結(jié)果來優(yōu)化微電極陣列芯片結(jié)構(gòu)，使電融合過程控制得到優(yōu)化。基于仿真分析設(shè)計(jì)了離散式電極和離散式凹槽電極結(jié)構(gòu)模型，并且對(duì)芯片加工工藝、材料、封裝技術(shù)等進(jìn)行了研究，成功研制了基于薄膜電極、離散式共面電極、離散式凹槽電極結(jié)構(gòu)的細(xì)胞電融合芯片。最后，在芯片和融合儀組成的細(xì)胞電融合平臺(tái)上進(jìn)行了多種細(xì)胞的電融合實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了新方法的有效性。

具體的說，論文研究的主要工作包括以下幾點(diǎn):

①細(xì)胞電融合理論分析及仿真研究在細(xì)胞介電電泳、細(xì)胞電穿孔等相關(guān)理論研究基礎(chǔ)上，利用有限元分析軟件COMSOL Multiphysics#174；對(duì)芯片內(nèi)介電電泳效應(yīng)下的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行了分析，為相應(yīng)的細(xì)胞排隊(duì)控制方法的建立與優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，建立了基于跨膜電位的單細(xì)胞穿孔模型，分析了電場(chǎng)分布態(tài)勢(shì)誘導(dǎo)的細(xì)胞跨膜電位分布情況，以及該效應(yīng)下電穿孔區(qū)域分布及電穿孔密度分析等；在此基礎(chǔ)上，基于電場(chǎng)聚焦效應(yīng)，分析了離散式共面電極、弧性凹槽電極、矩形凹槽電極結(jié)構(gòu)參數(shù)對(duì)電場(chǎng)分布態(tài)勢(shì)的影響，探討了各電極結(jié)構(gòu)下細(xì)胞跨膜電位分布情況，并從中選取定型了較優(yōu)的凹槽微電極陣列，研制了對(duì)應(yīng)的微流控芯片，從而優(yōu)化了電穿孔/電融合過程控制，可以有效避免多細(xì)胞融合以及改善融合率等。

②細(xì)胞電融合微流控芯片的優(yōu)化在理論分析和仿真計(jì)算基礎(chǔ)上，從芯片結(jié)構(gòu)、材料、加工工藝、封裝等方面對(duì)細(xì)胞電融合芯片進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，研制了三種芯片:基于薄膜電極、基于離散式共面電極、基于離散式凹槽電極的細(xì)胞電融合芯片。在材料選擇上主要采用低阻硅、金、鋁作為電極材料，采用聚酰亞胺多聚物、“Si O2-多晶硅-Si O2絕緣槽”+“浮地硅”結(jié)構(gòu)填充兩相鄰?fù)过X狀微電極之間的凹陷區(qū)；選擇了石英玻璃、SOI等材料作為芯片基底；同時(shí)選擇了軟光刻、IC工藝等制造工藝。這一系列芯片在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的生物相容性、抗化學(xué)腐蝕性及電氣性能等。

③基于微流控芯片的細(xì)胞電融合系統(tǒng)平臺(tái)的建立根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，利用細(xì)胞電融合芯片和細(xì)胞電融合儀，搭建了基于微陣列電極芯片的細(xì)胞電融合系統(tǒng)平臺(tái)。該實(shí)驗(yàn)平臺(tái)具有操作簡(jiǎn)便、可控性好、實(shí)驗(yàn)效果好等特點(diǎn)。通過顯微鏡和CCD構(gòu)成的圖像觀察和采集系統(tǒng)，可以清晰觀察并記錄細(xì)胞電融合的全過程，并且實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)融合情況隨時(shí)調(diào)整融合參數(shù)，獲得理想的排隊(duì)效率及融合效率。

④微流控芯片上細(xì)胞電融合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)研究及分析利用基于微流控芯片的細(xì)胞電融合系統(tǒng)平臺(tái)研究了多種細(xì)胞的排隊(duì)、融合實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)，包括K562細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。新研制的芯片解決了細(xì)胞吸附在凹陷區(qū)無法融合這一問題。此外，這些新設(shè)計(jì)的微電極也使電場(chǎng)更加集中，降低了排隊(duì)電壓和融合電壓。通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)探索獲得了細(xì)胞排隊(duì)及融合所需的電參數(shù)，并且得到了較高的細(xì)胞排隊(duì)率與細(xì)胞融合率。相對(duì)于PEG方法和傳統(tǒng)電融合法，新設(shè)計(jì)的微電極芯片的排隊(duì)及融合效率有了顯著提高，其中在薄膜電極芯片上K562細(xì)胞兩兩排隊(duì)效率為70.7%，融合率達(dá)到大約43.1%的水平；在離散式共面電極芯片上，幾乎100%的NIH3T3細(xì)胞排列在電極上，兩兩排隊(duì)效率達(dá)到69.8%，融合效率達(dá)到40%；在離散式凹槽電極芯片上，98%的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)入凹槽，大約67.9%凹槽內(nèi)的細(xì)胞兩兩排隊(duì)，融合效率達(dá)到了50.3%。

總之，通過對(duì)細(xì)胞電融合芯片的優(yōu)化設(shè)計(jì)，本論文研制出高排隊(duì)效率、高融合率的細(xì)胞電融合芯片，建立了集成融合芯片及電融合儀的細(xì)胞電融合微系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。在對(duì)多種細(xì)胞的電融合實(shí)驗(yàn)中，取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果。該研究為建立高效、自動(dòng)的細(xì)胞融合芯片系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)，有望進(jìn)一步應(yīng)用于實(shí)際研究，如雜交育種、體細(xì)胞再程序化等。