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神經退行性疾病與神經死亡密切相關,進而導致軸突束退化,導致神經功能喪失。細胞治療方法的最新發展為增強神經修復功效提供了潛在的可能性。神經干細胞(NSC)具有獨特的自我更新和多向分化能力,NSC分化為神經元的效率至關重要,這與實現其在神經退行性疾病治療中的臨床應用相關。
另外,神經營養因子(NF)作為調節神經系統病理的潛在治療因子受到了極大的關注。電刺激(ES)也被認為是神經損傷的有效治療方法。為了調節NSC分化的命運決定,微流控平臺已廣泛用于創建體外神經網絡模型。最近的研究在微流控芯片上開發了皮質紋狀體網絡,從而實現了軸突生長的突觸連接。微流體裝置的設計目的是分離突觸前和突觸后區室,這可以允許進入和操縱皮質軸突和紋狀體樹突之間的形成。此外,基于多微陣列電極(MEA)的生物電子平臺允許調制神經元網絡和電生理學表征。微陣列電極的主要優點是能夠監測神經活動的發育活動和動態響應。最近,多項研究成功證明了MEA與微流控芯片的集成,可以對結構化和可視化的神經網絡進行監測。因此,為了更好地觀察NSC的軸突再生和神經分化,這將是一個很好的研究方向。
這項研究開發了一種集成微陣列電極的微流控芯片,作為軸突損傷和再生的體外中樞神經系統模型。此外,這項研究中試圖探索微流體陣列電極系統中神經突生長與NF和ES協同效應之間的關系。為了實現這一目標,小鼠NSC被用作神經生長的原代細胞模型,并在微流體陣列電極系統中在有和沒有NF的情況下進行培養。ES在25 mV下施加1小時。該芯片的設計能夠通過分隔的微通道控制神經突的生長和神經細胞的分化。此外,還在微流控陣列電極芯片中證明了NF和ES對神經分化的協同作用。因此,該芯片可能成為研究神經退行性疾病和神經再生的有用工具。
設計原理
微流控陣列電極芯片的制作
制造了基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微流體裝置。微陣列電極(MEA)是通過電子束物理氣相沉積制造的。所生產的微流控陣列電極芯片通過注入入口用70%乙醇進行滅菌,并在細胞接種前用磷酸鹽緩沖液體清洗。
電化學性能表征
使用雙電極電化學系統對微流控陣列電極芯片的電化學性能進行了表征。通過將電極浸入神經分化培養基中5天進行長期穩定性測試來評估電極的穩定性。使用電化學分析儀進行循環伏安法(CV)和電化學阻抗譜(EIS)測量。
免疫細胞化學和成像分析
將微流控陣列電極芯片中培養并固定的細胞洗滌后,通過在DPBS中與3%牛血清白蛋白在室溫下孵育3小時,可減少非特異性蛋白質結合。隨后,在4°C下用一抗處理細胞與二抗孵育,并對細胞核進行染色。使用倒置共焦激光掃描顯微鏡獲取染色樣品的熒光圖像。通過Image J軟件分析標準化熒光強度和平均神經突長度。
數據介紹
微流控陣列電極芯片的設計
微流控芯片由兩個主通道組成:一個用于小鼠神經干細胞培養(左通道),一個用于衍生神經干細胞軸突(右通道)。細胞培養通道和衍生通道通過橋通道相連。如圖1所示,微陣列電極由兩部分組成,左側是產生電活動以分化神經干細胞的ES電極,右側是應用ES的軸突電極。此外,基于PDMS的微流控設備被仔細地排列在微陣列電極平臺的頂部,電極專門位于突觸前和突觸后隔室的下方。鉻/金電極是通過在5 nm厚的Cr粘附層上沉積50 nm厚的金制成的。突觸前電極(直徑30μm)位于軸突微通道左側以刺激軸突起始段產生動作電位(AP),突觸后電極(直徑50μm)位于軸突微通道右側。MEA的微電極排列在基質中,可用于監測神經細胞的胞外電活動。這種帶有微陣列電極的微流控芯片既可以分離神經室,也可以使用神經細胞培養重建大腦電路。
圖1微流控陣列電極芯片的實驗裝置。
微電極的電化學分析
微流體陣列電極芯片中循環伏安法(CV)的電化學表征,證明了明顯氧化和還原峰的電極的明確電化學響應(圖2A)。CV曲線表明,不帶NSC的介質和帶NSC的介質之間的陰極電荷存儲容量(CSC)不同。電極在不含和含有NSC的神經分化培養基中5天的穩定性結果如圖2B所示。計算出的CSC從沒有NSC的約45.3 F cm?2增加到有NSC的83.0 F cm?2。此外,具有NSC的介質中的電極的EIS提供了隨時間變化的阻抗大小∣Z∣與頻率的關系曲線(圖2C)。在分化過程中,與對照組相比,在5天的時間內監測電極上形成的匯合細胞層。正如預期的那樣,電極的阻抗在100 Hz時以與時間相關的方式增加。這些參數可以提供定義電極失效點的信息,電極失效點是指電極芯片剝離表面上的材料。此外,微通道中的阻抗隨時間增加的原因是電極污垢的影響造成的,可以通過吸收而不是溶液產生。
圖2微陣列電極的電化學表征。
微流控陣列電極芯片中NSC衍生神經細胞的神經突生長
使用微流控陣列電極芯片上不同范圍(0-100 mV)的電參數刺激NSC,以優化ES參數。與未刺激的NSC相比,在微流控芯片中用25 mV刺激NSC可增強其神經突生長。然后,檢查了是否可以在微流體陣列電極芯片中監測和量化NF和ES治療的效果。如圖3A所示,證實NSCs在不同條件下5天后分化為具有長神經突的神經細胞。此外,我們發現用NF和ES處理的NSC衍生神經元顯示出比其他組顯著更長的神經突(p<0.01)(圖3B)。接下來,為了量化這些星形膠質細胞或神經標記物的表達水平,我們使用Image J軟件對Tuj1或GFAP陽性部分進行圖像分析(圖3C)。
圖3微流體陣列電極平臺中的軸突生長。
軸突損傷和再生
為了再生醫學中未來潛在的治療應用,測試了微系統是否可用于體外損傷后測定軸突再生。使用抽吸泵將軸突室的軸突取出,并通過單獨使用NF或NF和ES治療來使受損的軸突再生。有趣的是,損傷后3天,NF治療促進了軸突再生,超出右通道邊界線(圖4A)。檢查了NF與ES治療一起在3天時對軸突再生的影響(圖4B)。形態學分析結果表明,軸突再生后,NF和ES治療組的平均神經突長度和平均神經絲熒光強度顯著高于NF治療組(圖5)。NF+ES治療組神經元的平均長度為204.3±47.9μm,明顯長于NF治療組(101.9±17.6μm;p<0.01)(圖5A)。此外,進一步評估了成熟神經元上的Tuj1和神經絲免疫化學染色,以進行軸突再生前后的比較。如圖5B和C所示,NF和NF+ES治療組軸突再生后Tuj1和神經絲的表達水平(分別為56.3±13.0%、80.2±8.7%)增加。
圖4微流控陣列電極平臺中軸突損傷與再生。
圖5微流控陣列電極芯片中平均神經突長度分析。
總結
在這項研究中,微系統比傳統培養系統具有更靈敏地檢測治療效果,同時能夠定量檢測NSC分化和軸突生長/再生。ES和NF的共刺激可以協同促進軸突伸長和NSC進一步分化為神經細胞。此外,NF和ES共刺激組比其他單一治療組或未治療組更能有效地抑制NSCs向星形細胞的分化。盡管需要進一步的研究來更好地了解基于細胞的研究的潛在益處和局限性,但我們的微電極芯片為藥物篩選提供了強大的NSC培養平臺,通過處理NF和ES治療來促進神經分化和軸突再生。
Comments
1.這項研究提供了陣列電極更多應用,為再生醫學提供了未來潛在的應用。
2.在電化學應用中電壓較小,不需要考慮電極絕緣避免緩沖液電解的問題,但長時間使用仍然會污染電極。
3.這項研究的前處理過程過于繁瑣。