研究簡介:土壤對大氣氫(H2)的氧化是形成大氣氧化還原狀態的關鍵生物地球化學過程。直到最近，這還被認為是一個非生物過程，但現在人們認識到，來自至少九個門的多種需氧細菌氧化大氣中的H2。土壤對大氣氫(H2)的氧化是形成大氣氧化還原狀態的關鍵生物地球化學過程1。直到最近，這還被認為是一個非生物過程，但現在人們認識到，來自至少九個門的多種需氧細菌氧化大氣中的H2[NiFe]氫化酶構成膜結合H2氧化金屬酶家族，支持細菌在富含H2的環境中需氧和厭氧生長；然而，這些酶通常不能氧化大氣中的H2，因為它們對H2的親和力較低。這些氫化酶尚未被分離出來，它們如何進化為選擇性氧化H2、耐受O2暴露以及與電子傳遞鏈相互作用仍然未知。值得注意的是，負責大氣H2氧化的氫化酶是否具有固有的高親和力，或者它們的親和力是否通過它們與呼吸鏈的相互作用來調節存在爭議。

為了解決這些知識空白，研究人員研究了需氧細菌恥垢分枝桿菌中大氣H2氧化的結構和機制基礎。該細菌擁有2種系統發育上不同的氫化酶——Huc（2a組）和Hhy（1h組）——均可將H2氧化至低于大氣壓的水平。直接從恥垢分枝桿菌中分離出Huc，并確定了其氧化大氣H2的結構和生化基礎。

Unisense微呼吸系統的應用

使用極化至+100mV持續1小時的Unisense 氫氣微電極以電流分析法測量純化的Huc的H2消耗。最初，用氣體飽和緩沖液（50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0）中的已知H 2標準物（0%、1%和10%H 2(v/v)）校準電極。該緩沖液的制備方法是，首先用100%氮氣將所有緩沖液鼓泡1小時，以除去任何痕量的氧氣，然后將100%H 2(v/v)鼓泡通過脫氧緩沖液10分鐘。在脫氣和再脫氣之前，所有緩沖液均含有最終濃度為200μM的電子受體（甲萘醌、NBT或芐基紫精）。對于每個讀數，1 ml 1%(8μM)H 2將含有電子受體的注入緩沖液添加到微呼吸測定室中，直至最終濃度為1％H 2。隨后將電極放入室中進行平衡。平衡后（大約10分鐘），通過針將BSA(0.3 mg ml-1)和Huc（0.3 mg ml-1 BSA中的1–3 nM）添加到腔室中，以免破壞溶液中的氣體平衡。使用SensorTrace Suite v3.4.00測量H 2濃度的變化，并且測量從添加Huc直到完成H2消耗的H2消耗的線性速率。H2線性速率計算八個時間點內約2.5μM H 2至0.0125μM H 2濃度之間的Huc消耗量。

實驗結果

為了利用空氣中存在的痕量H2，微量氣體清除細菌的[NiFe]氫化酶需要與在富含H 2的缺氧或缺氧條件下發揮作用的對應物相比具有不同的特性。通過對來自需氧細菌恥垢分枝桿菌的Huc的生化和電化學表征，研究表明了所需的O 2不敏感性和對H 2高親和力的特性。是這種氫化酶固有的，而不是由于與細菌細胞內的其他過程耦合而產生的。通過確定Huc的冷凍電鏡結構、分子動力學模擬以及FTIR和EPR光譜，我們提供了強有力的證據，證明活性位點至少部分排除O 2有助于酶的O 2不敏感性。我們的數據表明，Huc具有較大的電化學過電勢，使其能夠獨特地調節痕量H 2的氧化以及將產生的電子直接捐贈給呼吸輔助因子甲基萘醌。證明了Huc通過一種獨特且極不尋常的機制來獲取甲基萘醌。通過支架蛋白HucM，Huc復合物可以從膜中提取甲基萘醌并將其運輸94?至酶的電子受體位點。

圖1、Huc是一種高親和力的O2不敏感氫化酶。a)用200μM甲萘醌作為電子受體，對含有Huc或不含酶的密封小瓶頂部空間的H2濃度進行氣相色譜分析。Huc可以將低于大氣濃度（紫線）的H 2氧化至檢測限（綠線）。濃度，濃度。b)用200μM NBT作為電子受體，對含有Huc、大腸桿菌Hyd1或不含酶的小瓶進行氣相色譜分析。c)Huc在不同O 2飽和百分比的緩沖液中氧化H2的Michaelis-Menten動力學。d)具有不同電子受體的緩沖液中Huc H2消耗的Michaelis-Menten動力學，脫氣但含有痕量O2。e)固定化Huc蛋白膜在100％H2氣氛中的循環伏安圖。f)用包含氬氣、N 2和指示水平的H2的氣體混合物沖洗頂部空間的固定化Huc蛋白膜的循環伏安圖。

圖2、a)Huc寡聚物的冷凍電鏡密度圖，顯示其四個葉，每個葉包含兩個HucSL二聚體，四個位于中心的HucM亞基充當寡聚物的支架。b)由4個HucM亞基（殘基20至79）形成的中央四聚體的卡通表示，其中單個HucS 2 L 2葉顯示為上下文的表面模型。c)Huc低聚物的不對稱單元的卡通表示。d)復合冷凍電鏡密度圖，顯示Huc“體”區域，以及與細胞膜外圍相關的“莖”區域。e)HucM C末端區域（殘基80至189）的AlphaFold2模型的卡通表示，顯示它形成四聚體卷曲螺旋管。f)卡通圖，顯示根據冷凍電鏡結構重建的完整Huc復合物以及適合莖區域冷凍電鏡密度圖的HucM C末端AlphaFold模型。

圖3、a）環境空氣下Huc[NiFe]星團的立體圖。b）三個HucS[3Fe-4S]簇的結構。c)處于分離的氧化態（Huc-Air）和H 2還原態（Huc-H 2）的Huc的高溫（30K）EPR光譜。g=2.03處的各向同性信號（g是朗德因子）與氧化的[3Fe–4S]+簇有關，由于簇的還原，該信號在Huc-H 2中消失。在H2處理形式的Huc中沒有可辨別出歸因于還原的[4Fe–4S]+簇的信號。d）環境空氣中分離的氧化Huc的FTIR光譜，表明酶的[NiFe]活性位點采用與Ni-B狀態一致的氧化狀態。e）Huc[NiFe]活性位點，顯示Ni-B態羥基配體與簇中Ni和Fe離子之間的相對距離。f)HucSL二聚體，顯示了疏水性氣體通道的位置和寬度，該通道提供底物進入[NiFe]活性位點。g)左圖，距離與時間的關系圖，顯示在H 2存在的情況下進行HucSL分子動力學模擬過程中，H2與Huc[NiFe]活性位點之間的最近距離。h)與g類似，但顯示了在存在O2的情況下進行的HucSL模擬中O2相對于Huc[NiFe]位點的位置。i，HucL D-His166與近端和內側[3Fe-4S]簇的接近度以及未知配體的位置。

圖4、a)Huc低聚物的低分辨率冷凍電鏡重建中與Huc結合的甲基萘醌對應的密度。b)對應于Huc二聚體高分辨率冷凍電鏡圖中結合甲基萘醌的密度。由于掩蔽和對稱性平均，這些圖中沒有甲基萘醌尾部的密度。c)在遠端[3Fe-4S]簇的電子轉移距離內，HucS亞基對甲基萘醌頭基的協調。d)在高分辨率Huc冷凍電鏡密度圖中觀察到HucS的Tyr229的兩種構象。Tyr229在甲基萘醌存在時采用開放構象（頂部），而在甲基萘醌結合時采用互斥的閉合構象（底部）。e)對純化Huc中的Folch提取物進行高效液相色譜-質譜(LC-MS)分析。基峰色譜圖（左）顯示在24.6分鐘處有一個實質性峰，對應于m/z=804.66455（右）處的離子，這與β-二氫甲基萘醌-9的銨加合物一致，m/z=804.66531（下）。f)中心腔體Huc的混合棒和靜電表面表示，表明腔體表面襯有疏水殘基。g）HucM四聚體的視圖，顯示了封閉Huc內部疏水室頂部的脂質密度的存在。HHucM C端管的自上而下視圖，顯示管的內部排列有疏水殘基（左），并且可以容納甲基萘醌分子（右）。i0Huc還原甲基萘醌的模型，使用大氣H2氧化產生的電子。

結論與展望

本研究工作提供了一種通過選擇最佳基質剛度來精細調節破骨細胞分化的創新方法。多種需氧細菌利用大氣中的H2作為生長和生存的能源。這一具有全球意義的過程可調節大氣成分、增強土壤生物多樣性并推動極端環境下的初級生產。大氣H2氧化歸因于[NiFe]氫化酶超家族的未表征成員。然而這些酶如何克服在環境水平的催化毒物O2中氧化皮摩爾水平的H2的非凡催化挑戰以及衍生的電子如何轉移到呼吸鏈仍然懸而未決。在這里研究人員確定了恥垢分枝桿菌氫化酶Huc的冷凍電子顯微鏡結構Huc是一種高效的氧不敏感酶，可將大氣中H2的氧化與呼吸電子載體甲基萘醌的氫化結合起來。Huc使用狹窄的疏水性氣體通道以犧牲O2為代價選擇性地結合大氣中的H2，并且3個[3Fe–4S]簇調節酶的特性，從而使大氣中的H2氧化在能量上是可行的。Huc催化亞基在膜相關莖周圍形成八聚體833 kDa復合物，從膜上轉運并還原甲基萘醌94?。這些發現為大氣H2氧化的生物地球化學和生態學重要過程提供了機制基礎，揭示了依賴于長程醌傳輸的能量耦合模式，并為開發氧化環境空氣中H 2的催化劑鋪平了道路。本研究的極大地擴展了對減少呼吸醌的可能性的認識。這些發現為生物催化劑的開發開辟了途徑，因為迄今為止在全細胞和純化酶系統中應用的所有氫化酶都是被O2抑制的低親和力酶。Huc作為一種對氧不敏感的高親和力酶和第2族[NiFe]氫化酶，為開發在環境條件下運行的生物催化劑提供了基礎。