研究簡介:胍是一種在自然界中廣泛存在并且在人類尿液中排泄的化學穩定的氮化合物，它也被用于塑料制造、作為阻燃劑和推進劑的成分，在生物化學中作為蛋白質變性劑而知名。研究人員通過蛋白質組學、酶動力學和晶體結構分析等方法，揭示了N.inopinata中胍酶的活性和作用機制。他們發現，這種微生物能夠通過一個高效的途徑將胍轉化為氨，這一途徑不依賴于ATP（三磷酸腺苷），使其比其他已知使用胍作為氮源的微生物更有能量效率。在農業土壤和廢水處理廠的微生物群落中，胍可以作為硝化作用的底物。這一發現不僅為理解comammox在氮循環中的作用提供了新的視角，也為開發新的生物技術提供了可能性，例如在廢水處理和農業土壤管理中利用comammox微生物來提高氮的利用效率。探討了胍代謝在環境中的潛在應用，包括在廢水處理廠中去除廣泛使用的藥物如二甲雙胍（一種治療2型糖尿病的藥物）的環境殘留。二甲雙胍的降解產物之一就是胍，因此comammox微生物可能在環境中的胍循環中發揮重要作用。本研究給出了一個突破性的發現：一種名為Nitrospira inopinata的完全氨氧化微生物（comammox）能夠利用胍作為其唯一的能量、還原劑和氮源進行生長。

Unisense微呼吸系統的應用

Unisense微呼吸系統被用于測量和監測全細胞底物氧化動力學。unissense的微呼吸測量是一種用于評估微生物細胞對特定底物（如胍、尿素或氨）氧化能力的技術。使用O2 MicroOptodes和MicroOptode meter（Opto-F4 UniAmp），能夠實時監測在微呼吸實驗中氧氣濃度的變化。向含有N.inopinata細胞的MR室中注射不同的底物（如胍、尿素或氨），測量細胞對這些底物的氧化速率，并通過氧氣消耗來推斷。。通過監測氧氣的消耗，使用Michaelis-Menten模型來計算如Km(app)（表觀半飽和常數）和Vmax（最大反應速率）等動力學參數。在氨氧化過程中添加不同濃度的胍，評估了胍對氨氧化速率的抑制效應。測量細胞在不同底物條件下的氧氣攝取率，可以分析細胞的代謝活性和對不同底物的利用效率。

實驗結果

發現了一種全新的微生物代謝途徑，即完全氨氧化微生物（comammox）Nitrospira inopinata能夠利用胍作為其生長的唯一能源、還原劑和氮源。表明comammox微生物在氮循環中可能扮演著重要角色，尤其是在胍含量豐富的環境中。胍的代謝為comammox提供了一個額外的生態位，有助于它們與其他氨氧化微生物共存。胍作為一種潛在的硝化微生物生長基質，可能有助于開發新的生物技術，在廢水處理和農業土壤管理中提高氮的利用效率，以及在去除環境中的二甲雙胍等藥物殘留方面發揮作用。研究補充了對氨氧化微生物能量來源和代謝途徑的理解，特別是對于comammox微生物的生態重要性和它們在自然界中的分布。

圖1、胍降解所涉及的途徑和基因。a)胍羧化酶途徑。AH，脲基甲酸酯水解酶；CD，羧基胍脫氨酶；氣體、胍酶；GC，胍羧化酶；P i，無機磷酸鹽；用途，脲酶。b）胍酶途徑。c）在comammox微生物N.inopinata、AOB Nitrosospira multiformis和兩種用于胍分解代謝的細菌模型生物中，編碼參與在I型胍核糖開關調節下的胍降解的蛋白質的基因的排列。

圖2、comammox胍酶的系統發育和結構。a，尿素水解酶超家族的系統發育。圓圈表示具有功能特征的成員。所表征的N 1-氨基丙基胍丁胺酶包含在指定的胍丁胺酶進化枝中。灰色分支不對應于任何已知的功能，或者對于功能來說不是單系的。b，簡化的胍酶系統發育，使用生化特征的精氨酸酶家族成員作為外群（擴展數據圖4a中顯示了完整的樹）。根據先前的研究（N.inopinata胍酶位置Thr105、His222、Trp313和Glu344；補充表4），顯示了可能對胍催化重要的特定氨基酸殘基。c，comammox胍酶（氨基酸）和氨單加氧酶（amoA核苷酸）的系統發育關系的比較。同一基因組中發現的基因的樹尖相連。d，胍丁酶的靜電表面表示（從?5 kT/e（紅色）到+5 kT/e（藍色）），其中突出顯示了通往活性位點的隧道的建議入口（左）。右圖是方框所示區域的放大圖。由CAVER 57確定的隧道顯示為綠線，其寬度由點表示表示。活性位點殘基顯示為棒，鎳(Ni)和錳(Mn)離子分別顯示為綠色和紫色球體。胍顯示為棒，相應的范德華原子半徑表示為點。

圖3、N.inopinata在以胍為唯一能源、還原劑和氮的情況下生長。a，隨著時間的推移，胍的生物降解。將約50μM(150μM N)同位素標記的胍添加到N.inopinata的洗滌培養物中（與胍和銨預孵育1個月后），并孵育126天。使用高壓滅菌的N.inopinata生物質來控制非生物胍腐爛。在第84天和第112天，將大約50μM的胍額外添加到活生物質培養物中（灰色虛線）。銨從未增加到檢測水平(5μM)以上，尿素濃度保持在2.5μM以下。b、NO 2-和NO 3-產量（組合）。孵育結束時，添加的胍氮總量的78%被氧化為NO 2-和NO 3-。氮平衡顯示在擴展數據圖3f中。c，16S rRNA基因拷貝數的qPCR分析。使用韋爾奇雙樣本t檢驗進行統計分析；***P=0.0049，t=10.348，df=4，比較在126天時間點使用胍與不使用胍孵育的N.inopinata細胞數量。對于a–c，數據是五個生物重復的平均值±標準差。d、e，用胍(d)和不含胍(e)孵育107天后DAPI染色的N.inopinata細胞（紅色，10 ml培養物過濾到0.2μm GTTP過濾器上）的代表性圖像。所有五個生物復制都觀察到相同的結果。f，g，N.inopinata細胞與15 N-胍和13 C-碳酸氫鹽孵育107天后的氮(f)和相應的碳(g)同位素富集（使用nanoSIMS測量）。通過用來自頂空空氣的CO 2稀釋13 C-碳酸氫鹽、丙酮酸鹽形成CO2以及介質中同位素未標記的胍的分解來降低13 C-富集。顯示了來自一個生物復制的數據。

圖4、純化的胍酶和N.inopinata細胞的胍氧化動力學。a，異源表達的N.inopinata胍酶的動力學特征。Michaelis-Menten模型（紅線）適合胍酶（pH 7.5，37°C）的三次胍消耗率，并用于確定K m和V max。b，用微傳感器測量用胍預誘導約12小時的細胞，確定N.inopinata的全細胞胍氧化率。Michaelis-Menten模型（紅線）用于根據胍氧化速率確定表觀半飽和常數(K m(app))、V max和底物特異性親和力。

圖5、a、b）來自Ribe(a)和Haderslev(b)污水處理廠的大量comammox生物體中，胍APC超家族通透酶(APCP)和胍酶對底物加標（胍、銨、尿素）孵育的轉錄反應。Ribe和Haderslev實驗的宏轉錄組讀數分別映射到Ribe和Haderslev comammox MAG；TPM中顯示了所有時間點感興趣基因的轉錄水平。c、d，Ribe(c)和Haderslev(d)采樣時用于宏轉錄組學的重復中相應的胍濃度。

結論與展望

胍是一種化學穩定的氮化合物，可通過人體尿液排出，廣泛用于塑料制造、作為阻燃劑和推進劑的成分，并且在生物化學中作為蛋白質變性劑而廣為人知。胍在自然界中廣泛存在，并被多種微生物用作氮源，但以胍作為唯一底物生長的微生物尚未被鑒定。研究發現完全氨氧化劑（comammox）Nitrospira inopinata和可能大多數其他comammox微生物可以依靠胍作為唯一的能量、還原劑和氮源生長。N.inopinata胍酶同源物的蛋白質組學、酶動力學和晶體結構證明它是真正的胍酶。Unisense微呼吸系統被用于測量和監測全細胞底物氧化動力學，該技術的使用使得研究人員能夠精確地測量微生物對特定底物的代謝反應，并進一步了解微生物的代謝途徑和生態功能。Unisense微呼吸系統對于揭示N.inopinata如何利用胍作為能量、還原劑和氮源進行生長具有關鍵作用。再對含有comammox的農業土壤和廢水處理廠微生物組進行的孵化實驗表明，胍可作為環境中硝化的底物。胍作為comammox生長底物的鑒定顯示了這些全球重要硝化菌的意想不到的利基，并為它們的分離提供了機會。這項研究不僅揭示了comammox微生物的新功能，也為理解微生物在氮循環中的作用提供了新的視角，并為未來的環境生物技術和生態研究開辟了新的道路。