看法

探針耗氧量的方法學方法。 為了確保微探針的耗氧量與細菌的耗氧量相比可以忽略不計，我們在24小時內平行培養過程中監測了相同水的0.6-μm和0.2-μm過濾子樣本中的氧濃度（圖2）。 0.2-μm過濾水中的氧濃度在培養0至15 h期間保持恒定（215μm O2，圖2）。 培養15小時后觀察到的減少是由于通過過濾器的殘留小細菌的生長和/或由于儀器無法進行高壓滅菌而污染樣品造成的。 對于在含有大多數細菌的0.6μm（圖2）上過濾的樣品（平均值為90%±4%，n=31，Torréton等人未經過濾的數據未經過濾），這種殘留污染可以忽略不計。 微探針不消耗氧氣是一個相當大的優勢，因為在浮游水域中使用的大多數氧氣測量設備都涉及氧氣宏觀探針（Griffith 1988；Langdon 1993），其顯示內部氧氣消耗，導致氧氣消耗的高估，除非糾正。

圖2. 站N12（2003年5月6日）0.6-和0.2-μm過濾子樣本暗培養期間的氧氣濃度。

再現性。 使用Winkler方法的耗氧量估計通常是重復進行的。 在我們的研究中，測量氧氣濃度的設備的可用性使我們無法在重復中系統地估計氧氣消耗量。 然而，在一些情況下，我們檢查了重復水樣的再現性。 圖3顯示了同一站點的兩個樣本中氧氣濃度的時間過程非常相似。

圖3. 在N12站（2003年4月10日）0.6-μm過濾子樣本的黑暗培養期間的氧氣濃度。

氧微探針的精密度。 表2顯示了用于測量浮游生物系統中氧濃度的不同技術。 Winkler技術是最常用的技術，已經開展了許多工作來提高這種化學測定氧濃度的精度。 氧微探針的精度（0.05%）相當于Roland等人（1999）和Sherr及Sherr（2003）所述的高精度Winkler技術。

<0.6-μm過濾樣品中的呼吸趨勢-離散O2或CO2測量用于估計呼吸的一個主要缺點是，它們需要較長的培養時間才能觀察到與初始氧氣濃度的顯著差異。 然后假設耗氧量是線性的，這通常不容易用溫克勒滴定法在短時間內驗證。 在之前的一項研究中，Pomeroy等人（1994年）觀察到在每5小時進行一次離散氧測量的24小時孵化期間氧濃度時間過程的不同趨勢。 他們三分之一的數據沒有顯示氧濃度隨時間的線性下降。 因此，他們建議持續監測氧氣濃度，以便更好地估計細菌呼吸。 然后假設耗氧量是線性的，這通常不容易用溫克勒滴定法在短時間內驗證。在之前的一項研究中，Pomeroy等人（1994年）觀察到在每5小時進行一次離散氧測量的24小時孵化期間氧濃度時間過程的不同趨勢。他們三分之一的數據沒有顯示氧濃度隨時間的線性下降。因此，他們建議持續監測氧氣濃度，以便更好地估計細菌呼吸。

氧氣微探針的使用使我們能夠連續跟蹤呼吸瓶中的氧氣濃度。 然后將氧濃度數據與時間擬合成指數衰減方程，然后根據擬合函數的一階導數計算呼吸的時間過程。 同時，在重復0.6-μm過濾樣品的24小時黑暗培養期間，每5小時測定一次3H-胸腺嘧啶核苷摻入和細菌豐度。 圖4顯示了兩種對比營養狀態下（M10，貧營養狀態，D01，富營養狀態，見圖1）的呼吸、細菌豐度和細菌產生的時間過程。

圖4. 來自富營養化D01（a）和貧營養化場地M10（B）的0.6μm濾液的細菌豐度（?）、TdR摻入（）和呼吸（-）。 條形代表標準偏差。

在富營養化現場樣品中，顯著的呼吸僅在2至3小時后出現（圖4A），而在貧營養現場樣品中，僅在8至10小時后出現（圖4B）。

在D01（圖4A）中，TdR摻入率顯著增加，在孵育24小時內從6 pM h增加到180 pM h–1。 培養結束時，細菌豐度達到初始值的5倍。 呼吸在培養2小時后達到最大值（2.5μM O2 h–1），然后下降，直到培養15小時后變得幾乎為零。 TdR和細菌豐度的增加表明細菌可能不受資源限制。 觀察到的生產和消費之間的差異表明，正如del Giorgio和Cole（1998）所建議的，這兩個過程之間存在時間上的不耦合。 培養結束時，細菌豐度達到初始值的5倍。呼吸在培養2小時后達到最大值（2.5μM O2 h–1），然后下降，直到培養15小時后變得幾乎為零。TdR和細菌豐度的增加表明細菌可能不受資源限制。觀察到的生產和消費之間的差異表明，正如del Giorgio和Cole（1998）所建議的，這兩個過程之間存在時間上的不耦合。

來自寡營養部位的樣本（圖4B）在數小時的滯后期后顯示胸腺嘧啶核苷摻入增加。類似地，顯著呼吸僅在6小時的滯后期后才可測量，并且速率（0.6μM O2 h–1）在接下來的15小時內幾乎保持不變，而胸腺嘧啶核苷摻入率持續增加，直到培養結束時達到45 pM TdR h–1。在最初的15小時內，細菌數量增加了2.5倍，并在1.4×106細胞mL–1附近達到一個平臺。

這些結果允許優化培養時間，以測量貧營養和富營養場所異養細菌的耗氧量。此外，3H-胸腺嘧啶核苷摻入和細菌豐度的平行趨勢證明了該方法的局限性。事實上，應謹慎解釋結果，考慮到測量結果更能代表瓶內培養過程中發生的過程，而不是初始原位條件。

M10站的結果表明，只有當細菌數量和活性增加時，才能觀察到顯著的耗氧量。這種活性的增加可能是由于>0.6μm生物體的捕食釋放、過濾過程中脆弱細胞的破壞、玻璃材料上有機物的瓶效應吸附和濃縮，或培養過程中細菌群落的變化（Sch?fer等人，2000年；Massana等人，2001年；Fuchs等人，2000年；Gattuso等人，2002年）。Biddanda等人（1994年）已經表明，在墨西哥灣北部不同營養狀態的水域中培養期間，細菌的豐度和活性都會增加。在他們的研究中，在培養20小時后，高產陸架水域和低產坡水域的細菌產量分別增加了12倍和8倍。Likew在ise中，富營養化場所的細菌豐度增加了1.5倍，而貧營養場所的細菌豐度保持不變。因此，在這些孵化過程中，群落的進化和活性測量并不能真正代表初始條件。

因此，最好在最短的時間內培養，以保持最接近初始條件。因此，我們選擇以5小時間隔計算的斜率來測量細菌呼吸。這一時間是確保氧氣濃度顯著降低的最短時間和最小值之間的最佳折衷時間增加細菌DNA合成率（1.19±0.21倍）和豐度（1.42±0.09倍）。當我們觀察到氧氣顯著減少時，選擇間隔的開始。

連續O2測量與離散O2測量我們從16個營養狀態對比的站點共收集了27個樣本（表1）圖5顯示了我們研究期間觀察到的氧濃度的不同時間過程。圖6顯示了估算細菌呼吸的離散方法和連續方法之間的比較。

圖5.氧氣濃度和預測呼吸隨時間變化的不同趨勢表示。n表示我們研究期間觀察到的相應病例數。兩條線表示間隔（5小時）用于計算細菌呼吸。對于b型和c型，起始點從最小減少0.5μM O2開始設置（見正文）。

表1.在整個水柱上取樣的站的平均特征

27例中只有9例在孵化期間表現出恒定的O2消耗（模型a，圖5和圖6）因此，在計算細菌呼吸時沒有顯示出重要的偏差。在模型a中，估計細菌呼吸的離散方法將給出與通過連續監測氧氣濃度所估計的結果相似的結果。該模型表征了顯示低凈細菌產量的水樣的呼吸（圖7）。

圖6.通過離散和連續O2測量估計的呼吸比較。對于離散方法，呼吸是根據孵化開始和結束時（14小時或24小時）的氧氣濃度之間的差異計算的。

圖7.培養過程中觀察到的平均凈細菌生物量的分布，作為耗氧量模型的函數。誤差條表示標準偏差。

模型b在氧氣減少之前呈現5到10小時的滯后階段。一般來說，該模型是開放瀉湖樣帶（圖1）中寡營養樣品（7個樣品中的4個）的特征。在模型b中，通過離散方法估計的呼吸將導致氧消耗率的低估（圖6）。正如模型a所觀察到的，模型b是水樣的特征，表現出較低的凈細菌產量（圖7）。在模型c中，由于生物量和產量的增加，消耗量隨著時間的推移而增加。因此，與5小時時間間隔內的連續氧氣記錄相比，離散方法會高估BR（圖6）。根據模型c呼吸的樣本的特征是細菌凈產量最高（圖7）。最后，在模型d中，斜率在孵化開始時最大，隨后減小。這種趨勢是富營養化場所的特征，可能是由于營養資源的枯竭和隨后異養細菌活性的降低。對于模型d，用于估計細菌呼吸的離散方法將導致比使用連續監測確定的值更低的速率（圖6）。

這些不同的模型顯示了氧動力學的巨大可變性，因此難以選擇如何計算細菌耗氧量。同樣，在之前的一項研究中，Pomeroy等人（1994年）從24小時培養期間進行的離散氧測量中觀察到4種不同的氧趨勢。即使在我們的研究中，模型a/b和c/d可以分配給不同營養狀態的水，如細菌生物量凈產量所示（圖7），我們也不能將一個模型分配給任何特征點。這一結果強調了需要持續監測浮游微生物的耗氧量，以便以最小偏差評估呼吸速率。

圖8. 用細菌凈生物量（bgebpnet）估算的BGE與用3H-胸腺嘧啶核苷摻入（BGEBP）測定的細菌產量估算的BGE之間的關系。

BGE-BGE的估計通常通過細菌呼吸計算的細菌產量（用3H亮氨酸或3H胸腺嘧啶核苷摻入測量）的替代物來確定。在我們的研究中，我們根據培養過程中觀察到的用于細菌呼吸測定的豐度變化來估算凈細菌生物量（見材料和程序）。這樣，控制BGE的兩個進程在相同的條件下確定。圖8顯示了用凈細菌生物量產量（BGEBNET）估算的BGE與用3H-胸腺嘧啶核苷摻入（BGEBP）測定的細菌產量估算的BGE之間的關系。除了一個站點外，bgebpnet始終高于BGEBP?？墒褂镁€性回歸（R2=0.75，n=24，P<0.001）將BGEBnet和BGEBP與以下等式關聯：

這一趨勢表明，當根據示蹤物摻入估算的細菌產量估算BGE時，將導致低估細菌生長效率。這一低估可能是由于確定兩個過程的培養時間存在差異（TdR衍生細菌生產為1小時，細菌凈生物量生產為12至24小時）。

用于估計BGE的24小時培養可導致生物量和細菌產量的強烈變化，如圖4所示。細菌生物量和產量的這些變化會強烈影響BGE的測定。圖9顯示了根據圖4所示數據計算的24小時孵育期間BGE的時間過程。在富營養化現場（D01），BGE在孵化開始時等于7%，并且隨著時間的推移而強烈增加，在孵化20小時后達到53%的最大值。BGE的增加是由于孵化期間呼吸速率的強烈下降，伴隨著恒定的凈生物量細菌產量（圖4A）。Coffin等人（1993年）觀察到24小時培養期間細菌豐度和呼吸的類似模式，導致BGE有規律地增加。類似地，Pomeroy等人（1994年）觀察到氧呼吸減少（使用多點Winkler滴定法）伴隨著由亮氨酸摻入確定的細菌產量的規律性增加。這些觀察到的兩個過程的時間過程導致在孵化期間BGE有規律地增加。高初始呼吸速率伴隨著低細菌產量（導致低BGE值）可能表明這兩個過程并不像del Giorgio和Cole（1998）之前所建議的那樣耦合。

圖9. 在兩種對比營養狀態下，BGE在24小時孵化期間的時間過程。 用于計算BGE的數據來自圖4。 對于M10站，在10小時間隔內計算凈生物量產量，以獲得細菌豐度的顯著變化。 在兩種對比營養狀態下，BGE在24小時孵化期間的時間過程。用于計算BGE的數據來自圖4。對于M10站，在10小時間隔內計算凈生物量產量，以獲得細菌豐度的顯著變化。

相反，在寡營養站點M10，呼吸作用和細菌凈生物量的產生隨時間保持不變（圖4B）。 因此，BGE在孵化期間沒有表現出顯著的變化（圖9）。 24小時培養期間BGE的可能變化，如在富營養化現場觀察到的變化，強調有必要盡可能縮短培養時間，以盡量減少BGE測定中的偏差。 因此，BGE在孵化期間沒有表現出顯著的變化（圖9）。24小時培養期間BGE的可能變化，如在富營養化現場觀察到的變化，強調有必要盡可能縮短培養時間，以盡量減少BGE測定中的偏差。

使用氧微電極來研究細菌的呼吸作用以確定浮游細菌的生長速率——摘要

使用氧微電極來研究細菌的呼吸作用以確定浮游細菌的生長速率——材料和程序

使用氧微電極來研究細菌的呼吸作用以確定浮游細菌的生長速率——看法

使用氧微電極來研究細菌的呼吸作用以確定浮游細菌的生長速率——討論、意見和建議！