摘要

遠洋環境中的氧氣呼吸速率通常難以量化，因為我們的氧氣濃度測定方法的分辨率對于在小于24小時的瓶內培養過程中觀察到顯著的降低是有限的。在這里，我們提出了一種新的高靈敏度方法的評估，該方法將可切換微量氧（STOX）傳感器與人工降低O2濃度的全玻璃瓶培養相結合。該方法的呼吸速率檢測限與O2濃度成反比，對于初始O2濃度為500 nmol L-1的水，檢測限降至<2 nmol L-1 h-1。該方法在丹麥沿海水域和海洋缺氧水域進行了試驗。事實證明，它還可以在低耗氧率（~7 nmol L-1 h-1）下進行精確測量，并顯著減少培養所需的時間(≤14小時）與傳統方法相比。該方法提供連續實時測量，允許多種可能性，例如模擬氧氣減少速率以獲得動力學參數。我們的數據顯示，海洋細菌的表觀半飽和濃度（Km值）比之前報道的低一個數量級，介于66和234 nmol L-1 O2之間。Km值在不同的浮游微生物群落中有所不同，但我們的數據表明，在0.5–1 mmol L-1 O2濃度下測量可靠的呼吸速率是可能的，與在完全空氣飽和時測量的呼吸速率相當。

介紹

氧是生命的一個關鍵參數，生物體的呼吸耗氧量作為多個變量的函數已被廣泛研究。然而，氧呼吸不僅在生理學方面很有趣，而且是碳的生物地球化學循環和通過任何生態系統的有機物質流動中的一個主要因素。雖然我們地球的大部分地區被海水覆蓋，但對浮游生物群落呼吸（CR）的直接測量卻相對較少。由于用于測定O2濃度的應用方法（例如Winkler滴定法或Clark型傳感器）的分辨率低且檢測限高（，1 mmol L-1），因此很難通過實驗室培養海水來直接測量氧氣消耗率[1]。因此，直接呼吸測量在很大程度上被限制在最活躍的上層海洋200 m處，導致數據庫在季節、緯度和深度方面存在很大偏差[2,3]。在中層和深海海水、貧營養區和天然低氧水域（如氧氣最低區（OMZ））中發現的低速率的直接測量基本上是缺失的，我們通常依賴于估計值[4–6]。由于缺乏對海洋（150米以下）的微光區和暗區的測量，這兩個區域占海洋體積的98%，在光層多余有機物的礦化、儲存和埋藏中起著關鍵作用[7]，影響了我們獲得可靠的海洋浮游呼吸總體估計值的能力，以及由此得出的全球碳預算[8]。根據從占海洋表面80%的非生產性水生系統[9]獲得的有爭議的結果，尚未解決的討論仍在繼續。據估計，這些地區的呼吸速率大大超過初級生產力，表明當地凈異養[10–12]。另一方面，通過不同類型的數據分析，發現公海的有機碳收支基本上與有機碳平衡[13]。

同樣，缺乏氧氣最低區水域有氧呼吸過程的詳細數據限制了我們對其建立和發展的理解和預測能力[14]。此外，為了通過直接測量耗氧量來評估CR率，通常采用較長的孵育時間（$24小時），因為這是不可避免的，因為呼吸率低，技術靈敏度低。然而，長時間的孵化可能會導致群落結構和動態的變化，導致對比率的不切實際的估計[15,16]。因此，需要更可靠、更準確的測量方法，以及常規評估低放射性水域鉻含量的新方法。

最近，通過使用改進版的電子傳輸系統（ETS）酶法測定微型浮游生物呼吸速率[17]，報告了呼吸速率的較低檢測限[18]。在相對較短的時間內（在寡養水體中為3至5.5小時），通過還原2-對（碘苯基）-3（硝基苯基）-5（苯基）氯化四氮唑（INT），在體內估計ETS的活性。該方法的分析檢出限為64 nmol L-1不溶性福爾馬贊晶體（INT-F）。該值相當于80 nmol L-1 O2，使用電子傳遞系統（R/ETS比率）測量的呼吸速率和酶活性之間的比率（12.8）將ETS活性轉化為碳呼吸。因此，通過測量真實的原位生理速率而不是體外潛在呼吸，該方法應超越標準ETS測定的限制。盡管其檢測限有所提高，但這類酶法用于呼吸測量的有效性和準確性受到了嚴重質疑[6]。

近年來，開發了用于高精度測量氧濃度的新型傳感器。因此，高分辨率STOX傳感器和高靈敏度光學傳感器（optodes）是研究水生呼吸的合適且有希望的工具[19][20]。

為了克服與之前在低活性和低氧水域中的呼吸測量相關的技術和方法問題，我們開發并驗證了一種以低速率直接定量CR的程序。這是使用高分辨率STOX傳感器[19]在人為降低的O2濃度下完成的，并假設在低和高O2濃度下的速率是可比較的。需要較低的O2濃度才能達到該方法的最高靈敏度。然而，上述比較無法在低活性海洋水域進行測試，因為在高氧濃度下的吸氧動力學無法用任何標準方法可靠解析。因此，我們首先在高活性沿海水域進行了一項比較研究，其中氧消耗率由STOX法和標準溫克勒滴定法測定。此后，我們使用STOX方法評估來自熱帶北太平洋東部（ETNP）OMZ的海水中的CR率。此外，我們還介紹了各種浮游生物群落從完全有氧條件到幾乎零氧條件下的耗氧動力學；探索一個新的，描述不清的，有氧呼吸仍在發生的濃度范圍。

材料和方法

道德聲明

本研究中使用的三個丹麥地點的水的獲取和取樣無需特別許可。在“Thomas G.Thompson”號客輪的東熱帶北太平洋（ETNP）巡航（2012年3月至4月）期間，在墨西哥水域航行、取樣和工作，需獲得墨西哥政府的許可。對于所有站點和所有實驗，均未涉及瀕危或受保護物種。

圖1。培養瓶。培養用玻璃瓶，容積為1160 mL（注入紅色墨水以增加對比度）。A）用于插入STOX傳感器的開口（內徑8.1 mm）；B）用于壓力補償的長開口玻璃管（內徑2.5 mm）（管內注入藍色墨水以增加對比度）；C）玻璃涂層磁鐵（2.5厘米），用于持續攪拌。內政部：10.1371/期刊。波內。0105399.g001

研究地點和抽樣

從丹麥的三個不同地點采集海水和微咸水樣本（圖S1）。在三個季節（2011年6月至7月、2011年9月和2013年1月至2月）對兩個主要地點（圣城1號和圣城2號）進行了采樣，額外的圣城3號僅在2013年2月進行采樣，如下所述。1號站位于Randers峽灣（56u31912.2299N；10u13948.5999E），受其內部兩條河流的淡水排放和高有機負荷的影響[21]。采樣期間（2011年6月、9月和2013年1月），采樣點的鹽度范圍為7%至9%。2號站位于奧胡斯Marselisborg Marina附近的卡特加特（56u08914.3299N；10u12955.1999E）。采樣點非?？拷０毒€，采樣期間（2011年7月、9月和2013年1月）鹽度在16%到26%之間。2013年2月取樣的3號站位于丹麥北海海岸（57u0791299N；08u3791299E）漢斯霍姆港，鹽度為35%。收集表層海水，通過250mm篩網過濾以去除較大的動物群，并在采樣后3小時內將其裝在干凈的聚乙烯容器中運輸至實驗室。

在R/V Thompson（2012年3月和4月）上的ENTP春季巡航期間，該方法也被用作在東熱帶北太平洋（ETNP）氧氣最低區（4號站，16u29993.2599N，109u59900.5999W）的船上試驗。4號站距離墨西哥海岸約700公里（圖S1）。海水樣品用10 L Niskin瓶花環采集于110 m處，剛好低于氧氣層。在該深度，通過使用STOX傳感器的高分辨率原位氧氣分析，發現無法檢測到溶解氧[22]。取樣后不久進行瓶培養，如下所示。

設置和實驗

實驗室培養實驗在1160 mL的定制改良Schott Duran玻璃瓶中進行（圖1）。一根25厘米長的玻璃管（內徑0.25厘米）穿過瓶子一側的玻璃壁。它用于壓力補償，以便溫度-體積變化不會導致氣泡形成和其他不良影響。一根更寬的玻璃管（內徑0.8厘米）取代了原來的瓶頸，用于插入STOX氧傳感器。瓶子內容物僅在毛細管頂部的水-空氣界面處與空氣接觸（圖1b），但由于該毛細管的內徑較小，氧氣進入瓶子的傳輸可忽略不計（見結果部分）。STOX傳感器的直徑在8 mm瓶頸的0.1 mm范圍內，因此與空氣的接觸僅限于0.3 cm距離內的超薄水層（圖1 a）。由于STOX傳感器和8毫米頸部之間的強毛細管作用，任何體積變化將僅在壓力補償管中可見。

圖2。對照實驗的結果（實驗1）。顯示了具有不同氧濃度的四個不同重復。添加64 h 1 mL空氣，飽和0.05 M HCl，在毫質量水中，對應于244 nmol L-1 O2，用于傳感器校準。內政部：10.1371/期刊。波內。0105399.g002

在實驗過程中，瓶子被置于黑暗中，浸泡在恒溫（15uC和21uC）的水浴中。使用2.5 cm長的玻璃涂層磁鐵（Fisher Scientific）（圖1 C）進行連續攪拌，同時將裝有瓶子的容器置于磁攪拌器（IKA）頂部。

為了在測量氧氣濃度時獲得最高的相對分辨率，使用STOX傳感器時，必須在低氧氣濃度下工作。因此，通過使用混合有0.05%CO2的N2鼓泡來降低待研究水的O2濃度。

由于灌裝過程中的空氣污染，很難在瓶中獲得非常低的O2濃度，但以下程序可使初始濃度降至約100 nmol-1。將待調查的水與N2混合0.05%CO2鼓泡約15分鐘，同時將其封閉在一個10或20升的玻璃瓶中，該玻璃瓶只有一個小開口，以允許氣體逸出。然后，使用帶有泰貢管接頭的玻璃管虹吸管從儲液罐中注滿瓶子，同時仍在冒泡。泰貢是首選，因為它相對不透氧且透明，因此可以觀察到不需要的氣泡的存在。通過壓力補償管進行填充，同時通過插入8mm頸部的5mm泰貢管將惰性氣體流保持在瓶子內。在保持氣流和水流入的同時，將瓶子倒置，丟棄流入瓶子的前50-100毫升水；之后，瓶子被完全填滿。然后立即插入STOX傳感器，同時中斷通過虹吸管的水流。

所有試驗均在取樣后30小時內進行，培養最長持續時間為20小時。所有玻璃器皿先在0.1 M NaOH中清洗，然后在0.1 M HCl中清洗，以避免有機污染。

對STOX方法進行了測試（實驗1），并與丹麥沿海和峽灣水域的標準Winkler技術進行了比較（實驗2）；隨后，將STOX方法應用于海洋水域，以評估ETNP OMZ中間深度的CR率（見表3）。

實驗1-測試方法。氧內流和傳感器穩定性的控制實驗。在實驗1中，上述設置用于評估方法的準確性和分辨率，以及檢查外部和內部O2污染的可能來源。因此，用生物非活性水建立了一個對照實驗，其中在4個重復瓶中監測O2濃度，該瓶中裝有0.05 M HCl和軟化水，軟化水經過煮沸、冷卻，然后用N2氣體脫氣至低O2水平（圖2）。

實驗2-方法在沿海水域的應用和比較。在實驗2中，使用相同的設置和程序，在三個不同季節用STOX法測量了St.1、2和3的浮游生物群落呼吸率。為St.1、2和3設置一組平行培養瓶（n=3），以比較用STOX法（在低氧濃度下）獲得的CR率與用Winkler滴定法在空氣飽和時測得的呼吸率。此外，浮游生物群落的動力學參數由STOX方法獲得的數據建模。對于空氣飽和條件下的培養，重復上述相同的程序，但在這種情況下，用水輕輕地鼓入空氣，并用實心玻璃棒更換STOX傳感器以關閉瓶子。在孵育24小時之前和之后，通過Winkler滴定法在12 mL Exetainers（n=6）中采集氧氣測定樣品。按照Labasque等人[23]描述的程序，通過分光光度法測定O2濃度。

實驗3-海洋水域中的方法應用。在實驗3中，用STOX方法測量了太平洋St.4海洋樣本的浮游生物群落呼吸速率（圖S1）。

葉綠素a提取

對于每個站點，在開始瓶培養之前，通過Advantec GF-75玻璃纖維過濾器過濾1L海水，然后用96%乙醇提取色素，從取樣水中提取葉綠素a[24]。測量分四次進行，葉綠素a濃度根據Lorenzen方法計算[25]。

傳感器：原理、校準和電子學

STOX傳感器是一種安培式氧傳感器，具有就地零點校準的內置功能。該傳感器由內部氧微傳感器[26]組成，內部氧微傳感器位于外部微傳感器外殼內，外部微傳感器外殼配有額外的硅膜。在兩個膜之間，放置一個由多孔金制成的外陰極（前防護罩）。該前防護罩在20.8 V電壓下的極化消耗了從外部介質擴散到測量傳感器的所有氧氣，導致現場零電流測定。隨后前防護罩的去極化允許氧氣通過并到達測量陰極。測得的電流差與氧濃度成正比。由于每個測量循環都記錄了新的零點讀數，因此該信號與零點漂移無關，并允許定義零O2濃度。零點測定的高精度允許非常高的低O2濃度分辨率，而在接近空氣飽和的濃度下首選其他方法。與標準氧氣微傳感器相比，STOX傳感器具有較高的攪拌靈敏度，且整個循環的響應時間相對較長（20秒至幾分鐘），因此，它們最適合在氧氣濃度變化相對緩慢的攪拌介質中進行分析，如本文所述的瓶內培養。微傳感器是按照前面的描述制造的[19,27]。在每次實驗期間，通過向瓶子中注入已知體積的空氣飽和水，對每個傳感器進行校準。傳感器連接到PA8000八通道皮安計（Unisense a/S，丹麥），而前防護的極化和去極化由定制的定時器控制開關箱調節，前防護的開啟和關閉周期定時器設置為250秒。信號由Unisense ADC816 16位a/D轉換器采集，該轉換器使用Sensortrace Basic程序連接至便攜式PC（Unisense a/S，丹麥）（圖S2）。

圖3。與沿海海水孵育的STOX傳感器中氧氣消耗的時間過程。來自站點2水孵化的STOX傳感器數據示例（Marselisborg Marina，2011年9月）。僅繪制每個循環期間的最小和最大讀數，并用線連接。最大和最小讀數之間的差值用作O2濃度的測量值。信號的初始振幅（11 pA）對應于200 nmol-1瓶中的O2濃度。如紅線所示，在1h（2ml，600nmol-1）和6.7h（4ml，1200nmol-1）注射空氣飽和水。內政部：10.1371/期刊。波內。0105399.g003

動力學參數的數據分析與建模

在每組培養中連續記錄氧氣濃度，最長持續20小時。氧氣消耗率通過氧氣濃度隨時間的線性回歸計算得出。利用STOX方法獲得的數據，通過離散O2間隔上的運行斜率計算斜率。對于高于6 mmol L-1的O2濃度，使用2 mmol L-1間隔，并且隨著O2的減少，逐漸降低濃度范圍。線性模型的擬合通過確定系數r2進行評估。

Michaelis-Menten方程的動力學參數Vmax（最大呼吸速率）和Km（表觀半飽和常數）：

通過直接對每個復制的進度曲線（濃度與時間）進行非線性參數擬合來估計。數據符合方程（2），該方程描述了氧隨時間的逐漸吸收[28]：

式中，C（t）是氧濃度隨時間的函數，Co是所考慮間隔的初始濃度。Vmax和Km迭代變化，直到使用Excel中的解算器命令實現通過最小二乘法調整獲得的最佳擬合[29]。

為了測試動力學參數是否隨時間變化，在同一個瓶子中和幾個實驗中，通過在氧氣濃度接近零時注入空氣飽和水，測定了兩次Km和Vmax值。

為了在模型和實驗數據之間獲得更好的擬合，我們還測試了一個經驗關系，該關系最初是為光合作用的光飽和曲線而建立的[30]。Jassby和Platt方法表示呼吸速率與氧濃度的關系如下：

其中a是低氧水平下曲線的初始斜率。為了使用半飽和常數（Km），對方程進行了修改，采用以下關系式，表示符合Michaelis-Menten動力學的速率-濃度曲線的初始斜率：

結合方程式3和4：

與使用Michaelis-Menten動力學類似，培養過程中氧濃度的時間演變符合以下方程式：

遵循與上述相同的迭代過程。