結果

方法評價

實驗1-測試方法。氧內流和傳感器穩定性的控制實驗。低O2濃度下的耗氧量測定要求極高的精度，且裝置完全不受外部和內部O2污染[31]。為了確定低O2水平下的耗氧量，我們開發了一個全玻璃培養瓶，易于接近傳感器，其中唯一可能的O2進入是通過25 cm長的壓力補償毛細管和傳感器與8 mm玻璃管之間的薄水膜（圖1）。壓力補償管的寬度為2.5 mm，根據菲克第一定律（方程式S1，文本S1）計算的氧氣流量導致平衡時的輸入為0.05 nmol L-1 h-1，這是完全可以忽略的。從孵育開始，試管中的水與散裝水中的O2濃度相同，如果擴散是唯一的運輸方式，則在許多月內不會達到平衡[32]。然而，水的粘度確實會隨著溫度的升高而降低，因此可能需要在較高溫度下使用內徑較小的壓力補償管，以盡量減少湍流混合。除了湍流混合外，通過壓力補償管的輸送也可能因溫度變化而增加，從而導致管內的水移動。管道中的水流沿管壁流動較慢，因此任何水流都會促進混合。另一個入口點是STOX傳感器和周圍玻璃管之間的水膜。假設水膜厚度為0.05 mm，在0.3 cm長的管中，在平衡狀態下，只有0.02 nmol L-1 O2 h-1通過擴散通過該膜。然而，與壓力補償管一樣，我們不能排除湍流混合的可能性，例如由振動泵引起的湍流混合。因此，由于我們無法排除與大氣開放連接中的各種混合，我們決定通過使用生物滅活的0.05 M HCl脫鹽水進行對照實驗，測試是否可能泄漏到培養瓶中，該脫鹽水已煮沸、冷卻，然后用N2氣體脫氣至低O2水平。瓶內的氧氣濃度（n=4）在0.60小時內沒有增加（圖2），這證實沒有氧氣泄漏。另一方面，在孵化過程中，傳感器信號略有下降。根據特定的傳感器，我們記錄到信號的減少（培養64小時后），范圍為初始值的2.2%到21.3%（前5小時內信號的平均值）。因此，對于培養持續14小時的實驗，應考慮約1.8%的信號平均漂移。漂移在很大程度上取決于傳感器的特定特性，因此，僅使用在使用前經過徹底測試并保持極化數小時的傳感器，可以將漂移降至最低。然而，傳感器漂移似乎只導致測得的O2濃度下降的一部分。更詳細地分析圖2中的數據，似乎瓶子中氧氣的減少：STOX 1、2、3和4分別為0.14、0.07、0.04和0.15 nmol L-1 h-1（圖2），與初始氧氣濃度沒有強相關性。因此，似乎大部分減少可能是由于我們無法完全停止氧氣消耗，無論是生物還是化學。在這里，我們在濃度和絕對速率范圍內工作，控制實驗很困難，但基于大氣濃度下的低傳感器信號漂移速率[19]，如STOX 1（圖2）中所觀察到的，3天內信號漂移約三分之一的可能性也很小。因此，我們對孵化期間真實傳感器漂移的最佳估計為每14小時2%。

圖4。氧氣消耗率與1號站的氧氣濃度（Randers峽灣，2011年9月）。每種類型的符號對應一個特定的瓶子。復制瓶在初始O2濃度范圍內（從0到20 mmol L-1）孵育。速率計算為不同O2濃度變化間隔的斜率：每2 mmol L-1間隔為17-6 mmol O2，每1 mmol L-1間隔為6-1 mmol L-1 O2。然后在以下時間間隔內：500-300、300-100和100-5 nmol-1。內政部：10.1371/期刊。波內。0105399.g004

實驗2-方法在沿海水域的應用和比較。通過測量丹麥沿海水域3個不同站點和3個不同季節的CR率，對該方法進行了實驗測試，以覆蓋群落組成和代謝水平的最小變化。本研究的兩個主要站點（圣約翰海峽1號站和圣約翰海峽2號站，Marselisborg Marina，圖S1）分別于6月、7月、9月和1月取樣，并進行了三組反應堆試驗。由于我們的方法允許隨著時間的推移連續記錄氧氣濃度，因此我們能夠以高分辨率而非少量點監測和分析氧氣消耗過程（圖3）。因此，可以評估反應器中氧氣的減少是線性的，從高氧氣濃度下降到氧氣濃度#1 mmol L-1。在大范圍O2濃度的培養過程中，呼吸速率似乎與矩形雙曲線的一般形狀相匹配（圖4），并遵循Michaelis-Menten動力學。使用公式2（圖5）通過曲線擬合確定參數Vmax和Km。表1報告了三個研究期間St.1和St.2的估算Vmax值和表觀半飽和濃度Km。

圖5。沿海海水樣品中氧氣消耗曲線的建模示例。2011年9月，來自圣二號碼頭（Marselisborg Marina）的三個培養瓶（4、6、7）的耗氧實驗。氧氣耗盡后（6小時），將空氣飽和水注入“STOX 7”瓶中。點顯示STOX傳感器記錄的O2值。最大速率（Vmax）和半飽和常數（Km）通過最小二乘擬合（紅色實線）確定，使用公式（2），源自Michaelis-Menten動力學。該方法的擬合度相對較差，可能導致低估“STOX 6”的Km值。內政部：10.1371/期刊。波內。0105399.g005

在氧濃度降低時，通過STOX傳感器法測量的呼吸率和在空氣飽和時通過溫克勒滴定法測量的呼吸率得出了類似的結果。事實上，這兩種方法記錄的氧氣吸收率大致相同，只要裝有STOX傳感器的瓶子中的氧氣濃度高于500-200 nmol L-1，這取決于不同的群體（圖6）。低于這些值時，呼吸速率取決于O2濃度，表明群落正在接近其表觀Km值。2013年冬季，對北海的St.1和St.2以及額外的St.3進行了方法比較，結果相似（圖6）。來自St.1、St.2和St.3的樣品暴露于2–0.5 mmol L-1的O2濃度下，其吸氧率與暴露于285 mmol L-1 O2的樣品相似（在標準誤差范圍內）。

因此，分別使用STOX傳感器和Winkler滴定法進行測量，得出以下呼吸速率6標準誤差（n）：對于St.1，196.869（3）nmol L-1 h-1和203.8627（3）nmol L-1 h-1；對于St.2，163.562（13）nmol L-1 h-1和172.768.5（4）nmol L-1 h-1；對于St.3，98.664.9（6）nmol L-1 h-1和117.7613.5（4）nmol L-1 h-1。對于St.2浮游生物群落，在較低O2濃度（#500 nmol L-1）下進行的孵化似乎在略低于暴露于較高O2濃度（#2 mmol L-1）下的孵化達到最大速率（圖6 D和F）。

耗氧和隨后注入空氣飽和水后測定的表觀Km值與6月和9月St.1第一次耗氧曲線所得值相似。具體而言，對于6月的St.1，第一次消耗曲線的平均視在Km值6 St.誤差（n）為83611（3）nmol L-1 O2，在添加約1 mmol L-1 O2及其后續消耗后，視在Km值為118625（3）nmol L-1 O2。9月，注入約0.5 mmol L-1 O2后，表觀Km值首先為73625（3），然后為85626（3）nmol L-1 O2。然而，對于9月的St.2，第二次耗氧曲線導致表觀Km值從第一次運行的179增加到第二次運行的310 nmol L-1 O2（表1和圖5“STOX 7”）。

表1。測量的社區呼吸率概述。

只有當瓶子中的氧氣濃度達到納摩爾范圍時，St.1和St.2的呼吸速率才會顯著降低，對應于259-90 nmol-1 O2之間的氧氣呼吸微生物群落的表觀Km值。在夏季/秋季/冬季，這兩個地點的估算Vmax值不同（表1），在186和761 nmol-1 h-1之間變化。通過根據從Jassby和Platt經驗方法得出的數學函數（等式6）對數據進行建模，獲得了Km和Vmax的類似值，但總體而言，動力學參數稍低，從而更好地描述了實驗數據（圖S3）。使用這種方法，估計的Vmax值比使用Michaelis-Menten模型獲得的值更符合實際測量的呼吸率（CR）。這兩個位置顯示出相同的CR季節模式：夏季/秋季/冬季：605/262/223 nmol h-1（St.1）和238/206/156 nmol L-1 h-1（St.2），Km值在155-66 nmol L-1 O2之間變化。葉綠素a濃度（葉綠素a–表1）顯示，浮游植物群落的豐度隨季節的變化而變化，在St.1和St.2之間也有變化。截至目前，2011年6月Randers峽灣（St.1）樣本中的chl a濃度最高，其呼吸速率也遠高于其他樣本（表1）。發現St.1的chl A濃度和CR之間存在線性相關（r2=0.99）。

實驗3-海洋水域中的方法應用。該方法通過測量船上實驗中的鉻率，在海洋水樣上進行了測試。水樣在不同的瓶中以不同的氧氣水平孵化（圖7）。在培養14小時后，在三個重復瓶中檢測到線性氧氣下降。重復試驗中的呼吸率相似，平均值為7.460.3（3）nmol L-1 h-1，與暴露時的O2水平（950/270/100 nmol L-1）無關。這表明該群落的Km值明顯低于100 nmol L-1。

圖6。用STOX法和溫克勒滴定法測量鉻率的比較。通過STOX法（從0到2 mmol L-1，白色條）和溫克勒滴定法（在空氣飽和時，灰色條）測量不同O2濃度（B、D、F、H）下培養期間的耗氧時間過程（A、C、E、G）和呼吸速率。A、B：圣1號（蘭德斯峽灣）；C、D：濃度為0-2 mmol L-1的圣2號（Marselisborg Marina）和E，F：濃度為0-1 mmol L-1的Marselisborg Marina。G、H:St.3（漢斯霍姆）。比率平均為6個標準誤差（n=3）。Michaelis-Menten動力學參數和Jassby和Platt動力學參數（括號內）均已給出。內政部：10.1371/期刊。波內。0105399.g006

討論

在這項研究中，我們提出了一種測定浮游生物群落有氧呼吸速率的新方法，將超靈敏O2測定（在本例中是通過STOX傳感器）與人工降低O2濃度的瓶培養相結合。通過該方法，氧氣消耗率的分辨率與STOX傳感器最佳工作范圍內的氧氣濃度成反比，即從飽和降至約10 nmol L-1 O2。假設14小時間隔內的信號漂移小于2%（圖2），在100 nmol L-1 O2下可獲得約0.4 nmol L-1 h-1的呼吸速率檢測限，并且在500 nmol L-1 O2下可獲得約2 nmol L-1 h-1的分辨率。這應與溫克勒滴定法進行比較，溫克勒滴定法的初始值和最終值之差的準確度最多為0.15 mmol L-1[2]。對于14小時的培養，這對應于約10 nmol L-1 h-1的檢測限。培養時間的延長降低了Winkler方法的檢測限，比本文介紹的基于STOX的方法要低得多，但我們發現，如果培養時間超過20小時，呼吸速率會增加數倍[22]。因此，與之前的直接測量相比，基于STOX的方法將O2呼吸測量的靈敏度提高了一個數量級以上。因此，它還允許測定深海水域、貧營養區和缺氧區的極低速率，低至約1 nmol-1 h-1[33]。對于居住在墨西哥海岸附近ETNP OMZ中間深度的浮游生物群落，在14小時長的瓶培養過程中測量了低于10 nmol L-1 h-1的CR率（圖7）。

圖7。與海洋海水孵育的STOX傳感器中氧氣消耗的時間過程。2012年4月，在海洋站4號進行的船上實驗中，在3個重復瓶中氧氣消耗的時間過程。在3種不同DO水平下孵育的3個樣品的CR率相似（nmol-1 h-1）。CR率6標準誤差通過線性回歸確定，實驗的前三個小時由于傳感器信號上的噪聲而被丟棄。內政部：10.1371/期刊。波內。0105399.g007

用這種方法測得的速率與傳統溫克勒滴定法測得的速率之間有很好的一致性（圖6），證實了這種新方法的有效性。此外，該協議表明，通過在短時間間隔內人為降低樣品中的氧濃度，對CR率缺乏可檢測的直接影響；只要樣品暴露在明顯高于社區Km值的環境中。此外，該方法具有高分辨率和連續測量耗氧量的特點，為研究自然樣品中的動力學參數以及浮游生物群落對不同O2水平的響應提供了獨特的可能性。

丹麥三個測站（圖S1）（0.16–0.8 mmol L-1 O2 h-1）測得的呼吸速率與先前對公海上層混合層的估計或測量值處于相同范圍[1]。研究發現，調查沿海地區的地表水（，10 m）的平均呼吸速率為0.3 mmol L-1 O2 h-1，相當于沿海海洋地區組合數據集（0.3 mmol L-1 O2 h-1）的先前平均值[2,16,34]。這些監測站表現出不同程度的活動，正如人們所預期的那樣，這些地點受到不同程度的富營養化和有機負荷的影響。St.1位于一個長而淺的河口，受兩條有機負荷較高的河流排放的淡水的影響[21]，其吸收率最高，并且可能有一個非?；钴S的浮游生物群落。表現出較低呼吸率的St.2位于奧胡斯港外的沿?？ㄌ丶犹睾Ｋ?，有機負荷較低，浮游生物群落密度較低；St.3位于北海相對不太活躍的水域。最后，St.4是在開闊海域發現的低流速的一個例子。St.4處仍然相對較高的耗氧量可歸因于取樣深度（110 m）處存在深層次葉綠素最大值，同時細胞密度較高（參見Ulloa等人2012[35]，了解次葉綠素最大值的一般描述）。此外，呼吸速率的差異也反映了浮游生物活動的季節性，夏季較高，秋季和冬季較低，與chl a濃度的季節性波動趨勢相似（表1）。

然而，本次調查的目的不是為了確定丹麥沿海水域的準確呼吸速率，而是為了調查使用人工降低O2濃度的水測定呼吸速率的方法的有效性，以及測定低O2濃度下海洋和河口水中O2吸收的動力學。因此，我們沒有試圖密切模擬現場溫度條件，也沒有研究呼吸速率隨晝間光周期的變化，因為光周期剛過，呼吸通常較高[36]。我們決定通過直接建模氧氣濃度隨時間的變化來估計氧氣吸收的動力學參數，以避免線性化過程[37]的不準確和限制，以及使用因變量和推斷值（即斜率）代替測量值的連續誤差。Michaelis-Menten模型似乎對所調查的混合浮游生物群落的動力學進行了合理的描述，盡管該方程并不嚴格適用于具有不同動力學參數的異質種群[38]。

通過應用米氏動力學，我們假設聚集體中的擴散限制可以忽略。事實上，當細菌聚集時，由于鄰近生物體的消耗，它們會經歷較低的外部O2濃度。在厚生物膜的極端情況下，O2的吸收可以用半級動力學來描述[39]。浮游生物群落中總會有一些聚集，這將導致明顯的Km值高于細胞值。隨著電池尺寸的增加，擴散到電池的效率降低[40]，因此，我們可以預期大型電池的表觀Km值會更高。然而，海水中群落呼吸的主要部分（.70%）可歸因于尺寸等級為10 mm的生物體，而尺寸等級小于1 mm的生物體高達58%，通常以細菌為主[41–44]。由于未完全滿足Michaelis-Menten模型的假設，使用公式2建模的曲線與實驗數據非常吻合，但導致建模的Vmax與實驗檢測到的最大呼吸值不匹配。因此，我們嘗試應用Jassby和Platt（1976）的經驗模型，在這種情況下，我們發現了更好的一致性。兩種模型之間的主要區別在于，對于相同的假設Km值，通過改進的Jassy和Platt模型，在較低濃度下接近最大速率（Vmax）（圖S3）。開發原始模型是為了更好地模擬混合微生物群落的行為，如本研究中所研究的微生物群落。

在我們的反應堆實驗中估算的表觀Km值低于之前報告的海洋細菌[45]。然而，在這個數量級上，O2的半飽和常數在微生物界是一個廣泛存在的現象[46–49]，以及通過高親和力末端氧化酶從極低O2濃度下的有氧呼吸中獲取能量的能力[49–51]。事實上，O2的還原是一種（火用）反應，它可以提供足夠的自由能，以在極低O2濃度下為細胞過程提供燃料[50]。因此，毫不奇怪，只要氧氣可用，微生物就可以使用氧氣作為電子受體，即使濃度只有幾納摩爾[52]。

對來自公海和沿海地區的海洋樣品進行的元基因組分析表明，Km值為幾納摩爾的高親和力末端氧化酶的豐度非常低，而對培養細菌的分析表明，在734個受調查需氧菌中，93%存在此類氧化酶[49]。海水中缺乏這種高親和力末端氧化酶并不令人驚訝，因為大部分海洋都是完全有毒的，只有動物內臟中的細菌[53]，大型糞便顆粒和海洋聚集體中的細菌[54–56]暴露在高度降低的環境O2濃度下，它們可能會經歷納摩爾范圍內的O2濃度。另一方面，Kalvelage等人最近在含氧量最低的水域中報道了高親和力末端氧化酶[57]。然而，低親和力末端氧化酶的Km值約為200 nmol L-1，因此即使沒有任何高親和力末端氧化酶的浮游生物群落也可能具有如此低的Km值。我們的一些數據也表明，細菌群落更為多樣的沿海環境和低氧適應群落的海洋最低含氧量區的特征是明顯的Km值略低于200 nmol L-1。

呼吸速率可能與水的預處理有關。這可以從第二次耗氧實驗（圖5和表1:St.2*，2011年9月，6–14小時）中對Km值的不同估計中看出。長期暴露于完全缺氧是應該避免的一個因素，因為它通常會導致非常不同的速率和Km值。此外，由于應允許社區適應新的條件，應丟棄孵化前1-2小時的數據[58]。建議使用2至16小時的數據確定動力學參數。超過16–20小時的孵化可能會導致高度錯誤的數據，至少在公海水樣中是如此（L.Tiano等人在準備中）[22]。

我們意識到微生物過程體外測量的局限性[15,16,59]，但在所介紹的裝置中使用STOX傳感器為解決與先前測定海水呼吸速率相關的幾個問題提供了一個極好的解決方案。事實上，它是一種實時評估浮游呼吸的簡單而準確的方法，不需要使用轉換因子和估計值。例如，電子傳輸系統（ETS）方法是一種間接方法，必須通過經驗確定的算法將測量的潛在呼吸率轉換為體內呼吸率[60]。另一種間接方法是根據顆粒有機物（POM）通量進行估算[33]，這種估算受到許多偏差的影響[5,61]。

STOX傳感器的高靈敏度允許非常短的培養時間。此外，在整個實驗過程中，反應器中O2的減少在濃度超過估計Km值三倍時呈線性，這意味著穩定狀態社區[16]。因此，我們排除了通常與長期孵化相關的社區組成的重大變化[62]。

電化學傳感器已應用于本研究中，但也有可能使用新一代光電二極管。這些新開發的非常靈敏的光電二極管是STOX傳感器的一種有價值的替代品[20]。無論是否使用電化學傳感器或光電二極管，都應在記錄氧氣消耗前后進行仔細的現場校準，以驗證傳感器是否存在污垢。事實上，聚集體可能在STOX傳感器的尖端周圍形成；這種現象在富含硅藻的沿海水域（L.Tiano，個人觀察）中觀察到，光電極表面可能形成生物膜，從而導致錯誤的測量。

通過使用本文所述的技術，可以比較O2吸收速率與其他微生物代謝過程的速率，如通過高分辨率15N同位素技術獲得的N-轉化速率，并研究從有氧呼吸到無氧呼吸的轉換[63,64]。我們現在還可以詳細研究定義的低O2濃度如何影響自然環境（如海水（T.Dalsgaard，個人交流）或純培養物中的基因表達[22]。

支持信息

圖S1采樣點地圖。STOX培養方法通過來自丹麥沿海和峽灣水域3個站點的樣本進行測試（左側地圖）。丹麥采樣地點（N）：1號站、蘭德斯峽灣、2號站、馬塞利斯堡碼頭、3號站、漢斯霍姆。所有樣本均在距海岸線100 m的范圍內采集。該方法還用于評估熱帶北太平洋東部（ETNP）氧氣最低區（右側地圖）水樣中的浮游生物群落呼吸速率。4號站，距離墨西哥海岸700公里。該地圖顯示了代表150 m深度處以飽和度百分比表示的氧濃度的等高線，氧數據來自2009年世界海洋地圖集，美國國家海洋數據中心（海洋數據視圖）。（TIFF）

圖S2孵化裝置示意圖。監測氧氣消耗的設置，包括：1）換檔箱。2）前護罩的電源。3）ACD816bit A/D轉換器（Unisense A/S）、4）PA8000多通道皮安計（Unisense A/S）、5）計算機、6）磁攪拌器（IKA、實驗室光盤）上的水浴，其中包含裝有STOX傳感器和玻璃涂層磁鐵的玻璃瓶。在大約一米的實驗臺空間上，可以安裝實驗所需的所有設備，最多8個復制瓶和8個STOX傳感器。（TIFF）

圖S3動力學模型的比較。上圖：呼吸速率與氧氣濃度，使用相同固定參數比較Michaelis-Menten和Jassby及Platt方程。下圖：第2站一個樣本孵化過程中氧濃度的時間演變，以及比較Michaelis-Menten、Jassby和Platt方程，使用100%氧飽和度（173 nmol L-1 h-1）下測得的呼吸速率作為Vmax。（TIFF）

文本S1 STOX傳感器的耗氧量。（DOC）

文本S2不同動力學模型使用的比較和評估。（DOC）