滲透性沉積物在大陸架上很常見，是海洋生物地球化學循環的重要貢獻者。滲透性沉積物中的有機物以微藻為主，微藻作為真核生物，對細菌和古細菌有不同的厭氧代謝途徑。在這里，我們對流動反應器實驗進行了分析，表明溶解無機碳主要是由厭氧真核生物代謝活動產生的。在我們的實驗中，溶解無機碳的厭氧產生始終伴隨著大量溶解H2的產生，這表明存在發酵。在使用廣譜殺菌抗生素后，溶解無機碳和H2的產生持續存在，但在使用甲硝唑治療后停止。甲硝唑抑制真核生物發酵產氫的鐵氧還蛋白/氫化酶途徑，表明該途徑是產氫和溶解無機碳的來源。代謝組學分析表明，在缺氧開始時，脂質生成量大幅增加，這與微藻缺氧黑暗發酵的記錄路徑一致。細胞計數顯示沉積物中以微藻為主。在從研究地點分離的硅藻（Fragilariopsis sp.）和綠藻（Pyramimonas）的黑暗缺氧培養物中觀察到H2生成，證實了微藻進行發酵的假設。我們得出結論，微藻黑暗發酵可能是滲透性沉積物中重要的節能途徑。

微藻在全球范圍內普遍存在于透光沉積物中，其生物量通常超過上覆水域中的浮游植物1。在滲透性（砂質）沉積物中，其生物量可能占有機碳庫的10–40%，基于先前報告的碳與葉綠素a的比率2,3和高比例的功能性葉綠素4。相比之下，此前有報道稱，細菌生物量占砂質沉積物中有機碳庫的比例小于10%。這也與微藻在調節此類沉積物中碳流方面的優勢6相一致?？紤]到微藻的生物量很高，與細菌相比，可以合理預計微藻將承擔大部分碳礦化和能量生成途徑。盡管如此，人們仍然普遍認為細菌發酵和硫酸鹽還原是缺氧滲透沉淀物中溶解無機碳（DIC）產生的主要機制7。令人驚訝的是，尚未對新采集的沙子中的電子受體利用以及微藻在這些過程中的作用進行系統研究8。

滲透性沉積物的動態性質意味著微藻通常均勻分布在≥砂內15 cm，黑暗缺氧條件將盛行1,6。研究表明，混合在深色沉積物中的微藻可以在很長一段時間內（半衰期為6-22天）保持活性，突出了它們對這種動態環境的適應能力9。然而，它們如何在光照和氧氣波動下生存的代謝基礎尚不清楚。硝酸鹽呼吸此前已被證明能維持光合真核生物無菌培養物在黑暗缺氧條件下的存活10；然而，硝酸鹽呼吸是否是環境中的一種相關策略仍有待確定，它不太可能足以支持低硝酸鹽濃度寡營養系統中的微藻種群。發酵是微生物用來將碳礦化與能量生成結合起來的另一種策略。盡管一些微藻已被證明在黑暗缺氧條件下進行發酵，例如，綠藻11,12-迄今為止，還沒有研究量化這一點在環境中的重要性。

在這項工作中，我們首次研究了滲透性沉積物中缺氧微藻代謝的重要性。我們將流動反應器（FTR）實驗與微生物學方法相結合，以確定滲透性沉積物中DIC產生的主要因素和途徑。我們表明，微藻黑暗發酵是主要的代謝途徑，這是首次在環境中記錄到這一點。

光營養真核生物主導代謝

我們最初使用在菲利普港灣（澳大利亞）和科特明德（丹麥）收集的沉積物，比較了DIC生成率和電子受體利用率。我們使用FTRs比較砂柱入口和出口處的溶質濃度，以計算體積速率。在缺氧條件下添加50μM 15NO3?,FTR實驗表明，與DIC生成相比，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和N2的速率較低；在澳大利亞和丹麥樣本中，它們只能占DIC產量的不到10%（圖1a，b）。DIC生成率和硝酸鹽還原率之間的差距與Evrard等人201313和Marchant等人201614之前的觀察結果一致，表明這是一種常見但并非普遍的現象15。在硝酸鹽存在下，鐵（II）、硫化物和甲烷的生成速率分別小于0.6、0.2和0.05 nmol-ml?1小時?1，無法解釋觀察到的DIC生產率。我們排除了顯著的鐵還原速率以及隨后以FeS形式捕獲Fe2+或吸附到FeOOH上的可能性，因為不會產生堿度（<1.5 nmol ml?1），排除硅藻使用累積的細胞內硝酸鹽池17。我們還排除了非生物過程，如碳酸鹽溶解驅動DIC生成，因為沒有堿度生成。在有氧和缺氧條件下（p=0.76）以及在有無硝酸鹽的情況下（方差分析（ANOVA），雙因素復制，p=0.44），DIC的產生沒有顯著差異（圖1c）；這表明，負責在有氧條件下產生DIC的生物體能夠利用能量守恒途徑在缺氧條件下維持其代謝，硝酸鹽、鐵或硫酸鹽還原對此沒有顯著貢獻，與圖1a、b一致。

圖1|FTR實驗中測量的代謝。從澳大利亞菲利浦港灣（a、c、d）和丹麥科特明德（b）收集的沉積物。a、b、氧氣消耗量、DIC、亞硝酸鹽和二氮（as N）的產生量在測量氧氣消耗量后，在實驗中切換為缺氧狀態，N=4。c、在有氧和缺氧條件下，以及在硝酸鹽存在和不存在的情況下，DIC生成率，每個處理n=3。d、缺氧條件下的DIC生成：對照組（n=2），在50 mg l?1阿莫西林（n=2）和2 mmol?1 HgCl2（n=1）。所有誤差條均為一個標準偏差

為了闡明缺氧條件下DIC產生涉及的生物群，將含有澳大利亞沉積物的FTR暴露于三種海水儲層處理中：對照處理，其中一種加50 mg l?1份阿莫西林，1份加入2 mmol?1氯化汞2。氯化汞處理使DIC的生成停止（圖1d），表明碳礦化是由生物過程驅動的。然而，對照組和阿莫西林組的DIC生成率沒有顯著差異（ANOVA，單因素，p=0.80），表明阿莫西林沒有抑制負責碳礦化的主要微生物群落。阿莫西林是一種廣譜抗生素，已被證明在0.1至2 mg l濃度范圍內具有殺菌作用?1，取決于菌株18。如果細菌導致DIC的產生，我們預計阿莫西林治療組的DIC產生率會比對照組有所下降。這表明，滲透性沉積物中DIC產生的絕大多數是由真核生物而非細菌引起的。通過量化存在和不存在阿莫西林時的反硝化速率（主要是細菌過程），研究細菌對阿莫西林耐藥的可能性（參見補充圖1）。正如所料，在整個實驗過程中，與對照組相比，阿莫西林抑制反硝化作用的因子為2到5，這表明耐藥細菌不能解釋我們的觀察結果。

可能產生DIC的真核生物包括小型底棲動物、大型動物和微藻。我們排除了大型動物和小型動物的可能性，因為缺氧后DIC的產生持續了10天以上（數據未顯示），這會殺死這些生物，并且在沉積物中未觀察到大型動物。因此，我們假設DIC產生的來源是微藻，如硅藻、綠藻和其他真核微藻。與此相一致的是，細胞計數顯示研究地點有多種微藻群落（見補充表2）。硅藻特別豐富，每毫升超過105個細胞，其中雙耳屬、球蟲屬和脆孢屬的硅藻種類最多。利用碳與葉綠素a的比率40（參考文獻3），將沉積物葉綠素a含量換算為微藻總量，得出沉積物微細胞底棲生物的碳含量為850–860μg?1干沉積物，約占沉積物總有機物含量的57%，突出表明這些生物在DIC生產中可能占主導地位。

缺氧時真核生物的黑暗發酵占主導地位

在證明海洋系統中主要的呼吸電子受體不能解釋DIC的產生后，我們尋找了其他可能導致碳礦化的潛在來源。有趣的是，我們通過微傳感器實驗觀察到，氫氣開始產生～缺氧開始后36小時。FTR中的H2濃度達到44±10μmol l?1和23±4μmol l?1（數據未顯示）分別在存在和不存在硝酸鹽的情況下（圖2a）。這些濃度幾乎比之前報道的2至6μM細菌發酵產生的最大瞬時H2濃度高一個數量級（參考文獻19,20）。這些值對應于26±7 nmol-ml的生產率?1小時?1和13±2 nmol ml?1小時?1，而此時這些色譜柱中DIC的生成率分別為120±46和80±36 nmol-ml?1小時?1分別在含和不含硝酸鹽的缺氧處理中（數據未顯示）。添加濃度為150μmol l的抗生素環丙沙星?1至色譜柱對產氫沒有影響（圖2a）。單種分析表明，環丙沙星的EC-50值在15至51 nmol之間?1對于典型的革蘭氏陽性菌21、22和241 nmol?1為革蘭氏陰性菌putida23。已經證明，真核生物對環丙沙星的敏感度要低得多，因為綠藻物種羊角硒藻（Selenastrum capricornutum）和亞首烏偽麒麟菜（Pseudokirchnerilla subcapitata）的EC-50值在9000 nmol/l之間?1和56000 nmol?1（參考文獻24）。盡管存在環丙沙星，但在對照和硝酸鹽處理中，H2的生成都持續存在，并且在整個實驗過程中確實持續增加。這有力地表明，與DIC生產一樣，H2生產不能歸因于細菌來源，因此可能是由真核生物產生的，已知真核生物能夠在缺氧條件下通過發酵產生H2 25。

圖2|滲透性沉積物中的H2和代謝物生成。顯示了FTR實驗（a–c）和培養物（d）的結果。a、在存在和不存在50μM硝酸鹽的情況下產生氫氣。實線和虛線表示從有氧條件到缺氧條件的變化，以及添加150μmol l?1個環丙沙星，n=3。b、對照組產氫量和20 mg l?1甲硝唑，n=3。c、與好氧條件相比，制氫過程中代謝物的相對濃度，n=3。d、五種硅藻和一種在黑暗中缺氧培養的綠藻培養物的產氫量，n=6。誤差條表示標準偏差。

有兩種經過充分研究的真核生物代謝過程可以產生H2：光生物代謝和黑暗發酵代謝25。在光生物生產中，來自水（直接生物光解）或有機化合物（間接生物光解）的光激發電子轉移到鐵氧還蛋白，然后轉移到[FeFe]-氫化酶，從而產生H2 26。相反，黑暗發酵代謝涉及有機化合物（例如，細胞內儲存的淀粉）的糖酵解分解。生成的丙酮酸隨后被丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶（PFR）氧化為乙酰輔酶A，生成二氧化碳25。然后乙酰輔酶A轉化為儲存的脂質。PFR還原的鐵氧還蛋白又被[FeFe]-氫化酶再次氧化，產生H2 27。光生物制氫可以排除，因為這些途徑需要光照，但所有實驗都是在黑暗中進行的。因此，負責觀察到的產氫的最可能途徑是黑暗發酵代謝。低濃度甲硝唑28可有效抑制還原態鐵氧還蛋白向氫化酶的電子轉移，而氫化酶是進行黑暗發酵所必需的。與該產氫途徑一致，我們觀察到服用5 mg l?1與對照治療相比，甲硝唑有效抑制H2生成（圖2b）。

隨后，我們研究了通過黑暗發酵產生的有機最終產品的命運。微藻的黑暗發酵除了產生H2和CO2外，還會產生多種有機最終產品，這取決于微藻的種類、途徑和環境條件12,29。例如，衣藻分泌醋酸鹽、乙醇、甲酸鹽或甘油的比例因物種而異30。此外，一些藻類根本不會從細胞中釋放發酵產物，而是在細胞內積累。例如，Inui et al.（1982）31發現，細眼蟲產生大量蠟酯，這些蠟酯儲存在細胞質32中，在恢復到有氧條件下，這些蠟酯被再次氧化生成ATP。我們無法使用固相微萃取（SPME）和GC/MS分析檢測柱出水中的任何酒精或揮發性脂肪酸，檢測限<1μM，這表明發酵產物主要儲存在細胞內。因此，我們對產氫條件下從黑暗缺氧FTR收集的沉積物進行代謝組學分析，以檢測可能的儲存產物。與有氧條件相比，這表明磷脂和神經酰胺增加了三倍，油酸增加了五倍（圖2c）。這與之前針對綠藻（圖3）25記錄的發酵產物乙酰輔酶A合成脂質的過程一致。

圖3|沙沉積物中底棲藻類代謝的概念模型。在這種充滿活力的環境中，漣漪遷移和沉積物再懸浮有規律地將藻類細胞移動到許多厘米深的沉積物中，那里是黑暗和缺氧的。在這些條件下，微藻會進行黑暗發酵，產生大量H2和脂質25。酶名稱為丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶（PFR）和鐵氧還蛋白（FDX）。輕度陰影區域表示沉積物中的氧濃度下降。黃色陰影區域表示缺氧滲透性沉積物。

反應1和2表明葡萄糖分解生成油酸和其他發酵產物的可能化學計量比，并且在標準條件下是自發的。在非標準條件下，無論H2和CO2分壓高（0.8 atm），這兩個反應都保持自發；然而，在pCO2和pH2<0.3 atm時，反應2變得最有利（參見補充圖2）。

使用反應1和反應2的組合，可以獲得大范圍的CO2:H2生產化學計量比。直到～缺氧48小時后，表明在開始類似于反應2的反應之前發生類似于反應1的反應或凈H2消耗量。一旦開始凈H2生產，其生產時間為～DIC產量的20%；然而，我們注意到總H2生產率很可能高于此值。與其他沉積物生態系統類似，產生的大部分H2更有可能立即被棲息在沉積物中的呼吸性氫營養細菌回收33。微生物生態學研究表明，這些沉淀物中有大量的好氧和厭氧細菌33-35，其系統類型類似于已知的氫化細菌26、34、35。如果我們假設反硝化作用是主要的電子匯，并且由氫營養作用驅動，2H2:NO3?化學計量比，則總H2產率可能是此處測量的釋放量的兩倍。目前尚不清楚為什么會釋放H2，因為細菌通常會快速消耗H2。我們推測，在高度動態的沙土環境中，細菌生物量無法累積，并且在環境變得更加靜態后，細菌生長需要幾天到幾周的時間才能利用所有的H2。為了支持這一假設，我們觀察到沙子變得高度硫化～從現場收集后1周。

從沉積物中分離出的藻類產生H2

為了進一步證實微藻產生H2，我們從研究地點分離和培養了兩個最主要微藻屬的代表（見補充表2）。從菲利普港灣分離到五種硅藻（均為脆性硅藻屬）和一種綠藻（吡喃單胞菌屬）的無菌培養物。在黑暗缺氧條件下培養證實，所有六種培養物都能快速產生H2，在缺氧培養118小時后，濃度達到800±450 nM（圖2d）。雖然綠藻可以發酵生成H2（參考文獻36），但據我們所知，這是首次觀察到硅藻產生H2。之前已經觀察到，此類生物體含有發酵產生H2所需的基因（參考文獻12），即PFR和[FeFe]氫化酶，從而支持我們的觀察結果。人們早就認識到，硅藻可以在黑暗中存活數周37，它們可以通過在黑暗缺氧條件下異化硝酸鹽還原來實現這一點38。雖然這種機制在相對富營養化的棲息地（如瓦登海）是可行的，而瓦登海在冬季具有較高的硝酸鹽濃度，但這種機制不太可能在相對貧營養的棲息地（如菲利普港灣）是可行的，水柱中的硝酸鹽濃度非常低（通常<1μM），并且存在著對少量硝酸鹽的激烈競爭。因此，我們提出，發酵是這些優勢生物在缺氧期間持續存在的主要機制。

總結

這里給出的結果挑戰了在高能滲透沉淀物中使用氧化還原級聯的缺氧代謝途徑的傳統公式39,40。我們在此證明，先前確定的滲透性沉積物中的碳礦化途徑（例如，硝酸鹽呼吸、硫酸鹽和鐵還原）和生物體（即呼吸細菌）不能解釋缺氧期間DIC的產生。相反，微藻介導的黑暗發酵可能是主要的代謝途徑，導致H2釋放和DIC生成?？紤]到光的穿透足以支持正的凈底棲生物群落的產生，可以發生在沿海海洋的33%以上41，這可能是一個全球重要的代謝途徑。同樣合理的是，產生的H2被好氧和厭氧呼吸細菌循環利用，從而在滲透性沉積物的時空變化生態系統中形成生態和生物地球化學。根據這些發現，我們目前正在研究該生態系統中碳礦化和H2代謝的分子途徑。還需要在實際水流環境中進行進一步研究，如原位或水槽中，以調查該生態系統中H2循環的動力學。

方法

方法，包括數據可用性聲明和任何相關的加入代碼和參考，可在本文的在線版本中獲得。

2016年8月8日收到；2016年10月21日接受；2016年11月28日在線發布；2016年12月14日在線更正