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神經細胞電生理技術主要包括:膜片鉗技術(patch clamp recording technique,PCRT)和在體多通道微電極陣列神經信號技術(In vivo multi-channel microelectrode array for neural signal recording technique,M-NEMEA)。
在體多通道同步記錄技術是采用細胞外記錄的方法來檢測神經元群的同步電活動。該系統包括微電極陣列、數據采集和分析系統。應用這一技術可同步記錄多個腦區的大量神經元的電活動,研究不同腦區的神經元放電在時間和空間上的聯系,進而通過分析神經元的放電模式來研究大腦對外部事件的編碼機制〔20〕。
多通道在體記錄技術,能在自由活動的動物腦內,觀察和記錄大腦局部區域幾十個、上百乃至上千個神經元的活動狀況,是目前作為分析群體神經元在網絡水平編碼機制的有效工具〔21〕。John C Lilly在1949年采用多電極陣列植入的方法研究靈長類的行為和神經元的放電關系,利用了25個微電極記錄到了610個神經元的放電〔22〕。在20世紀中期,研究人員用毛細玻璃管拉制了玻璃微電極。玻璃微電極的發明,使研究者可以將電極尖端插入神經細胞內,記錄細胞體或軸突、樹突內的電位變化,推動了神經電生理學細胞水平的研究。
體多通道微電極陣列神經信號技術的技術特點
M-NEMEA通過離體神經網絡活動的多通道電生理同步檢測的方法,可研究神經網絡群體特征的電生理特性,是目前研究神經網絡發育和功能特征的重要方法。隨著計算機技術的發展和微加工技術的提高,微電極陣列技術已經廣泛應用于離體培養神經網絡放電模式的檢測中,從而為研究神經突觸的可塑性,神經網絡功能連接的形成與再生,以及神經網絡發育的規律及生理節律提供了技術支持和保障。目前用于體外神經網絡電生理檢測的微電極陣列及多通道電生理檢測系統多購自國外廠家,具有軟件操作界面人性化,系統做工精良,系統穩定,處理功能強大等優點,但也存在不足。例如購買價格昂貴;易損耗,微電極陣列(microelectrode array,MEA)重復利用率低,多次使用后,表面電極材料會被損耗,影響信號記錄;商業化系統的功能相對固定,不易進一步升級,不能完全滿足實驗室實驗需求〔24〕。
M-NEMEA在視神經細胞的研究及應用
M-NEMEA作為細胞外記錄的方法,通過對神經元群同步電活動的檢測,可以同時采集大量細胞的動作電位的詳細信息,從而為研究大腦神經細胞及細胞之間相互作用提供了重要的技術支持〔23〕,具有重要的意義。Tusa等〔25〕人利用微電極細胞外記錄的方法對貓初級視皮層感受野進行系統的繪測,繪制出皮層17區和視野的拓撲對應關系圖。陳昕等〔26〕采用玻璃微電極在貓的初級視皮層17區進行細胞外記錄,并結合光學成像法定位貓初級視皮層17區不同部位的視野拓撲的離心度,結果表明神經元的感受野的離心度與光學記錄到的結果十分接近,從而為大面積確定皮層細胞感受野在視野中的位置提供了快速和較準確的方法。史學鋒等〔27〕采用微電極陣列神經細胞信號采集技術對斜視性弱視貓行細胞電生理檢測,觀察視皮層21a區神經細胞眼優勢的相關變化,結果發現與正常組相比,模型組21a雙眼細胞比例明顯下降,在紋外視皮層斜視性弱視的病理不足更為明顯,神經細胞眼優勢明顯轉移至正常眼。姚軍平等〔28〕用微電極陣列神經細胞信號采集技術檢測22 d正常大鼠(Long Evans大鼠,下同)、22 d單眼剝奪大鼠、100 d正常大鼠、100 d單眼剝奪大鼠眼優勢柱的分布,結果發現22 d正常大鼠、100 d正常大鼠、100 d單眼剝奪大鼠視皮層眼優勢柱分布為對側眼優勢,22 d單眼剝奪大鼠視皮層眼優勢柱分布為同側眼優勢,表明正常視覺環境下發育的Long Evans大鼠,眼優勢柱分布為對側眼優勢,其在幼年期視皮層具有可塑性,在異常的視覺環境下可影響其眼優勢柱的分布;而在成年時,Long Evans大鼠視覺可塑性終止,異常的環境不能影響其眼優勢柱的分布。劉虎等〔29〕用微電極陣列神經細胞信號采集技術檢測斜視性弱視貓紋狀皮層細胞功能和放電水平,結果發現較正常組相比,模型組皮層細胞數量明顯減少,眼優勢未轉移;模型組與正常眼相比眼驅使皮層細胞的高端截止空間和最優勢空間頻率顯著下降,表明驅使皮層細胞的空間特性和兩眼拮抗作用是導致斜視性弱視的原因之一。謝芳等〔30〕用微電極陣列神經細胞信號采集技術記錄幼貓初級視皮層V1區峰電位信號和場電位信號,觀察眼優勢指數的變化,結果發現場電位和鋒電位的眼優勢指數呈正相關,表明雙眼視刺激的平衡程度直接影響神經元的整合作用。徐鵬景等〔31〕通過在體胞外記錄的方法研究視覺系統中二階信號和一階信號是由相同還是不同的通路來完成的。發現大多數膝外體細胞對二階信號存在調制反應,但反應強度低于一階信號,并且二階信號反應中的非線性成分與線性成分的比值高于一階信號反應,表明貓外膝體上一階信號和二階信號的處理可能是由兩類不同的傳遞通路來完成的。
丁娟等〔32〕將健康Wistar大鼠48只分2組進行不同目的研究。第一組健康Wistar大鼠24只分為4組,每組6只,除正常組外,其余各組在出生后14(P14)天制作右眼單眼形覺(MD)模型。采用細胞外記錄技術觀察各組視皮質II/III層突觸傳遞LTP誘發率,以及各組在高頻刺激(HFS)刺激后,興奮性突觸后電位(EPSP)及群峰電位的變化。結果表明,①各視皮質II/III層LTP誘發率正常P45天組最高(5/6),最低的為MDP90天組。②高頻刺激后EPSP斜率和群峰電位(PS)幅值不同時段與基礎突觸傳遞水平的比較:EPSP斜率和PS幅值在正常P45天組、正常P90天組HFS后0、30、60 min提高顯著(P<0.01)。同一時間點比較,HFS后30、60 min各組EPSP斜率以及PS幅值與基礎值之比,組間比較具有顯著性差異(P<0.01)。從而表明大鼠皮質LTP誘發呈視覺依賴性,MD可降低剝奪眼對側視皮質LTP誘發率;EPSP斜率,PS幅值對高頻刺激的反應受年齡和異常視覺經驗影響,年齡越大,以及視覺經驗的異常(單眼形覺剝奪)會降低視皮質對高頻刺激的反應。第二組仍采用細胞外記錄技術觀察各組注藥后10、30、60、90 min對基礎突觸傳遞水平的影響。給藥90 min后,給予視皮層質Ⅳ層高頻刺激,觀察藥物對視皮質Ⅱ/Ⅲ層LTP誘導的影響。結果表明:①不同濃度天然藥物A對基礎突觸傳遞水平的影響:在MD對照組和正常組側腦室給予人工腦脊液(ACSF)后10、30、60、90 min EPSP斜率和PS幅值并無明顯變化,天然藥物A隨給藥時間延長能提高EPSP斜率和幅值,高劑量組更具有顯著性。②天然藥物A對高頻刺激誘導的Ⅱ/Ⅲ層LTP的影響:HFS 30、60 min后,EPSP斜率和PS幅值MD高、低劑量給藥組、正常組高于MD對照組(P<0.01)。從而表明:天然藥物A側腦室注藥能提高MD成年大鼠視皮質Ⅱ/Ⅲ層基礎突觸傳遞水平,增強EPSP以及PS幅值,呈劑量依賴性加強HFS對視皮質Ⅱ/ⅢLTP的誘導,提高突觸傳遞效能。