材料和方法

地下水源和特征

在ONKALO隧道中，在387.9 m深度處鉆了一個直徑為76 mm的鉆孔，表示為ONK-KR15（Toropainen 2011)。鉆孔于2011年2月23-28日以8.6°的傾角進行，總長度為79.96 m。無金屬封隔器系統將鉆孔中的含水層與隧道巖面75.0–75.2 m處的深度399 m隔離；含水層的透射率為7.6×10-9 m 2 s-1。地下水被這個封隔器系統引導到下面描述的FC，然后通過兩個平行的1/8英寸聚醚醚酮(PEEK)高壓液相色譜質量(IDEX Health and Science,Oak Harbor,華盛頓州，美國）。封隔器系統中示出了圖1和在別處詳細（Pedersen的描述2005）。該系統通過使用6毫米不銹鋼管來屏蔽暴露在空氣中的鉆孔部分中的PEEK管。地下水的第二個來源是一個76毫米直徑的鉆孔，表示為ONK-PVA6，在ONKALO隧道中鉆探的深度為318.7 m（Toropainen 2009）。鉆孔于2009年11月3-4日以14.8°的傾角進行，總長度為35.15 m。無金屬封隔器系統將鉆孔中的含水層與327 m深度的隧道巖面隔離32.7-32.9 m。用于化學分析的地下水樣品于2012年4月12日從這些鉆孔中收集并立即運送到Teollisuuden Voima，在那里根據內部協議進行化學分析或分包給外部實驗室，如別處詳細描述的（補充表3 Pedersen等人的。2008）。

表1試驗地下水地球化學參數及各參數對比

表2.2012年1月11日采樣的ONK-KR15地下水、2012年4月17日采樣的用于填充流通池循環系統的ONK-KR15地下水和ONK-PVA6地下水中溶解氣體的濃度

表3 2012年1月11日鉆孔ONK-KR15和2012年4月17日鉆孔ONK-PVA6的地下水中最可能的可培養微生物數和細胞總數；SD=標準差，n=觀察次數

圖1.實驗系統的圖像。(a)用于隔離含水層的封隔器系統，流動池(FC)與碎石相連。(b)FC以四對四的方式串聯安裝在地下，安裝在帶有流量計和泵的機架中。地下水從孤立的含水層通過FC循環并返回含水層70天。然后將FC斷開并轉移到(c)實驗室中的溫度控制流通池循環系統。

用于現場工作的FC系統

三個相同的FC現場系統，每個系統包括四個FC，一個微型泵（Micropump GAH，帶有PEEK葉輪的V21 J系列；Labinet，哥德堡，瑞典），兩個壓力計（S-11，40 Bar 4–20 G1/2；WIKA–AB瑞典語INDUSTRI儀器，瑞典哥德堡），流量計（50 PROMAG;E+H公司Flowtech AG，索倫蒂納，瑞典）和4-L膨脹容器（彼得森2005）被安裝在一處放置在ONKALO隧道的容器387 m深度并連接到ONK-KR15中的封隔器系統（圖1）。每個FC由內襯聚二氟乙烯(PVDF)塑料的鋼管（長300毫米，直徑65毫米）組成。每個FC還有一個120毫米長的PVDF插件，帶有一個22×32毫米的開口，支持110克碎石顆粒，提供大約850厘米的巖石表面積2假設平均直徑為3毫米的球形巖石顆粒，微生物粘附和生物膜形成每FC個。

巖石顆粒經過熱滅菌（160°C 5小時），取自ONK-KR15鉆孔的鉆孔核心，位于相交含水層的大致位置。在所述插入件的每個端部三個流動穩定確保水通過每個FC（Pedersen的均勻分布的緩慢的層流1982）。FCs于2012年2月7日安裝。地下水循環在原位3.2 MPa的壓力下以22-25 mL min的流速在含水層中70天-1。三個現場系統中循環的地下水總量分別為2562、2381和2287 L，由流量計記錄。

生長實驗的配置

將暴露于ONK-KR15地下水70 d的12個FC在壓力下從ONKALO隧道運輸到瑞典M?lnlycke的實驗室，并且在三個流動池循環系統(FCCS)中的每一個中安裝了四個重復的FC，從而得到總共三種治療可能性（圖1）。然后按如下方式添加硫酸鹽和ONK-PVA6地下水：在室溫（RT，20°C）下填充三個內襯聚四氟乙烯的500-mL不銹鋼鋼瓶（304L-HDF4-500-T；Swagelok，G?teborg，Sweden）包括：1)500 mL ONK-KR15地下水，2)5 mmol Na 2 SO 4溶解在500 mL ONK-KR15地下水中，以及3)5 mmol Na 2 SO 4溶解在500 mL ONK-PVA6地下水中。每個鋼瓶與一個FCCS中的循環地下水連接，導致每個FCCS的總循環量為5500 mL。

這些處理在下文中表示為對照、硫酸鹽和硫酸鹽+ONK-PVA6。這些地下水循環的開始日期是2012年4月26日，結束日期是2012年8月7日，實驗持續時間為103天。流速保持在22-25 mL min-1，對應于上大約1 mm s的流量-1巖石顆粒。四個耐壓微傳感器E h電極對，配備一個尖端直徑為400-600μm的鉑微電極（RD500；Unisense A/S，奧爾胡斯，丹麥）和一個尖端直徑為90微米的Ag/AgCl參比電極–110μm的凝膠穩定電解質（REF100；Unisense）安裝在每個FCCS中。電極代表了安裝在不銹鋼流通池中的標準玻璃Unisense微傳感器的改進。電極連接到兩個八通道mV放大器，這些放大器將記錄的電壓轉換為數字信號，隨后使用SensorTrace Basic軟件（1.9版；Unisense A/S）每600秒收集一次并存儲在Microsoft Office Excel文件中。

完整采樣進行了六次，即在第0、7、19、40、61、82和103天，用于如下所述的分析。每次采樣時，排出和排放循環水20 mL；將兩個25-mL體積的水收集在無菌的50-mL聚丙烯(PP)管（Sarstedt，Landskrona，瑞典）中并深度冷凍直至進行硫酸鹽分析，然后將10mL的水收集在一個15-mL的無菌PP管中以立即使用ATP分析。使用注射器在帶丁基橡膠塞的厭氧玻璃管（編號2048-00150；Bellco Glass,Vineland,NJ,USA）中收集六份10 mL的水用于MPN分析，并收集10 mL用于CHAB分析。將兩個10 mL體積的水收集在PP管中，用0.02μm過濾、中和的甲醛保存至最終濃度為2.5%，并分別分析TNC和VLP。此后，對9 mL水取樣進行硫化物分析，并使用0.2μm注射式過濾器（Minisart，Sartorius注射式過濾器，親水性；Fisher Scientific，G?teborg，Sweden）對兩個5 mL體積的水取樣并儲存在-20°C直到可以進行乙酸鹽和乳酸鹽分析。

接下來，使用0.2-μm注射器過濾器(Minisart)對25 mL水進行采樣，用于立即分析亞鐵。使用0.2-μm注射器過濾器(Minisart)對兩個10-mL體積的水進行采樣并深度冷凍直至進行DOC分析。最后，收集10 mL地下水用于pH分析，收集100 mL地下水用于氣體分析。在每次采樣時，總共采集了334 mL的水。在第0天和第103天對水進行采樣后，從每個FCCS中的兩個FC中的每一個中收集了一批巖石顆粒，用于隨后分析附著的ATP量和16S rDNA多樣性。

乙酸鹽、乳酸鹽、有機碳、亞鐵、硫酸鹽和硫化物分析和pH值

使用酶促UV方法（用于乙酸鹽的試劑盒編號10148261035和用于乳酸鹽的試劑盒編號10139084035；Boehringer Mannheim/R-Biopharm AG，達姆施塔特，德國）使用Genesys 10UV分光光度計（Waltham Fisher Scientific，Waltham Fisher Scientific）測定乙酸鹽和乳酸鹽濃度,MA,USA)進行檢測。用于溶解有機碳(DOC)分析的樣品在分析前稀釋1-100倍以獲得最佳分析濃度范圍。25 mL樣品通過0.2-μm親水注射器過濾器(Minisart)過濾并在-20°C下深度冷凍，直到根據CSN EN 1484方法在ALS Scandinavia AB（T?by，瑞典）進行分析。不確定度為分析值的±20%。使用SulfaVer 4方法（方法編號8051，程序680；HACH Lange AB；范圍0.03–0.73mM，分布的95%置信限為±10%）分析硫酸鹽。使用比色亞甲藍方法分析硫化物，不確定度為±17%（瑞典標準方法SIS 028115）。使用1-10菲咯啉方法（方法編號8146，程序255，范圍0.4-54 mM，分布的95%置信限為±11%；HACH Lange AB，斯德哥爾摩，瑞典）測定亞鐵濃度。在從FCCS中提取后立即測定5-mL子樣品的pH值，使用Schott CG84310 pH計（Schott AG，Mainz，德國），配備根據制造商說明校準的BlueLine 13 pH電極（VWR，斯德哥爾摩，瑞典）.

ATP分析

ATP生物質試劑盒HS（編號266–311；BioThema，Handen，斯德哥爾摩）用于測定地下水中細胞的總ATP。這里使用的ATP的生物量的方法進行了說明，在細節測試和評估為使用芬諾斯堪底亞盾地下水（Eydal和Pedersen 2007）。該方法也用于附著在巖石顆粒上的生物質，但進行了以下修改：從每個FCCS的兩個FC中的每一個中取樣大約10個巖石顆粒，并將其置于ATP提取溶液中并進行分析。

跨國公司和VLP

的TNC mL-1使用Hobbie等人設計的吖啶橙直接計數法測定10 mL樣品中。（1977年）和由彼得森和Ekendahl（改性1990）。使用與SYBR金（分子探針，Eugene，OR，USA）直接計數法根據高貴富爾曼（確定VLP的總人數1998年）。

氣體采樣和分析

使用壓力容器如其他地方所述，收集水樣品（Hallbeck和Pedersen 2008）。將樣品轉移到真空容器中，在室溫下真空（即水蒸氣壓）蒸發掉水中的任何氣體；轉移時間約為20-30分鐘。提取后，氣體被壓縮并轉移到10毫升注射器（SGE Analytical Science，墨爾本，維多利亞，澳大利亞），并測量提取的氣體和水的體積。隨后將捕獲的氣體轉移到一個6.6毫升的玻璃小瓶中，小瓶用丁基橡膠塞塞住，并用鋁卷邊密封。小瓶先前已被抽真空并用N沖洗兩次2，并在高真空(1 Pa)下放置。添加硅膠脫水劑以吸附氣體中殘留的任何痕量水。然后使用氣相色譜進行分析。

使用和配備了兩種不同的色譜儀，如下所示。H 2(<20 ppm)Ar和CO 2在配備CP7355 PoraBOND Q 50 m×0.53 mm ID色譜柱、CP7536 MOLSIEVE 5A PLOT 25 m×0.32 mm ID色譜柱和脈沖放電色譜柱的Bruker 450氣相色譜儀上進行分析氦離子化檢測器(PDHID)(Bruker Daltonics Scandinavia AB,Solna,Sweden)。He和N 2在Varian Star 3400CX氣相色譜儀（Varian Analytical Instruments，Varian AB，Bromma，Sweden）上使用熱導檢測器進行分析，柱溫檢測器、檢測器和燈絲溫度分別為65、120和250°C。氣體使用Porapak-Q色譜柱（2 m×1/8英寸直徑；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA）和分子篩5A色譜柱（6 m×1/8英寸；Sigma-Aldrich)以氬氣為載氣。CH 4、C 2 H 6和CO在Varian Star 3400CX氣相色譜儀(Varian Analytical Instruments)上使用火焰離子化檢測器(FID)以65℃的烘箱溫度和200℃的檢測器溫度進行分析。使用Porapak-Q色譜柱（2 m×1/8英寸直徑；Sigma-Aldrich）分離氣體，并在FID上用N 2作為載氣。

栽培介質

培養基為CHAB制備和NRB，IRB，MRB，SRB，AA，和AM的最可能的號碼分析如別處所描述（Hallbeck和Pedersen 2008）。培養時間約為8周，以確保結果中包含生長緩慢的微生物。

從MPN培養物、地下水和生物膜中提取DNA

根據制造商的方案，使用MO BIO PowerWater DNA分離試劑盒（目錄號12888）從地下水和最可能數(MPN)培養物中提取總基因組DNA，使用MO BIO PowerBiofilm DNA分離試劑盒從附著在巖石顆粒上的生物質中提取（目錄號24000–50），均來自美國加利福尼亞州卡爾斯巴德的MO BIO實驗室。本工作中使用的MO BIO提取試劑盒的提取體積為100μL。

使用配備PowerWater套件過濾器單元（MO BIO Laboratories）的水過濾器的高壓不銹鋼47毫米過濾器支架（X4504700；Millipore AB，Solna，Sweden）對地下水進行壓力過濾。過濾器支架配備了減壓閥（Swagelok SS-RL3S6MM；SWAFAB，Sollentuna，瑞典）和壓力計，能夠相對于環境含水層壓力在200到400 kPa之間調節過濾器的壓降。0.05–0.2 L min的流速-1 2012年4月17日，從ONK-PVA6和ONK-KR15隧道鉆孔中以過濾地下水。ONK-KR15中高滲透性含水層的地下水過濾體積約為57 L ONK-PVA6中的低滲透含水層為14 L。

從選定的MPN培養物中，使用真空抽吸將9 mL培養物過濾到0.22-μm濾水器（目錄號14880-100-WF；MO BIO Laboratories）上。使用無菌、無DNA的鑷子，在第0天從三個FCCS中的每一個中收集40個巖粒并匯集（2克巖石），并在第0天從每個FCCS中收集80個巖粒并匯集（4克巖石）103;這些巖石顆粒直接放入制造商提供的空生物膜DNA提取容器中。

使用ND-1000紫外可見分光光度計（Nanodrop Technologies，Wilmington，DE，USA）測量總提取的核苷酸濃度，并使用帶有MXPro軟件的Stratagene MX3005p熒光計（Agilent Technologies，Santa Clara,CA,USA)和Quant-it Picogreen試劑盒（目錄號P7589；Molecular Probes），根據制造商的規格。提取的DNA保存在-20°C，隨后用于測序。

MPN培養物的克隆和16S rDNA測序

MPN培養微生物的物種多樣性通過其細菌16S rDNA序列來衡量。PCR擴增中使用的通用的16S rDNA正向和反向引物27F和1492R，分別（泳道1991）。熱循環條件為98°C 30 s、98°C 30 s、60°C 30 s和72°C 30 s 30個循環，最終72°C 5 min。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上進行凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外光照射。然后使用QIAquick凝膠提取試劑盒（目錄號28704；QIAGEN，Solna，瑞典）按照制造商的方案純化擴增產物。為了產生平端iProof聚合酶產物的3′A突出端，將1μL Taq聚合酶（目錄號18038-042；Molecular Probes）和額外的dATP添加到反應混合物中，然后在72°C。

將純化的樣品克隆到線性化PCR 2.1-TOPO載體中，并轉化到化學感受態TOP10′F大腸桿菌使用TOPO TA克隆試劑盒（目錄號K4550-01；Molecular Probes）按照制造商的方案細胞中。隨機選擇含有插入物的白色克隆，并將每個菌落接種到含有卡那霉素（40 mg mL LB瓊脂平板上，-1）的并在37°C溫育過夜。提取重組質粒，隨后使用Value Read Plate service（Eurofins MWG Operon，Ebersberg，Germany）和M13rev(-29)測序引物（5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′）和M13uni(-21)測序引物進行測序(5′-TGT AAAACGACGGCCAGT-3′)由Eurofins MWG提供，用于16S rDNA克隆的Value Read Plate服務。

原始數據序列進行篩選使用Bellerophon的程序（Huber等人的嵌合序列。2004年）。使用Geneious 6.0.3軟件包（Biomatters，奧克蘭，新西蘭）分析和比對序列數據。的16S rDNA的參考基因的大腸桿菌布羅修斯與登錄號J01695用作用于對準的序列掩模的16S rDNA克隆（Huber等人。2004年）。此外，將克隆與BLAST核苷酸數據庫中可用的序列進行比較。使用核苷酸-核苷酸算法或16S rDNA微生物算法分析序列同源性。與數據庫記錄相似度<99.9%的序列以登錄號KC676781到KC676786提交到GenBank數據庫。

454來自地下水和FC生物膜的DNA的Pyrotag測序、處理和分析

針對細菌16S rDNA v4v6區域的簡并正向518F(5′-CCAGCAGCYGCGGTAA-3′)和反向1064R(5′-CGACRRCCATGCANCACCT-3′)引物用于在454 Roche GS-FLX系統(454 Life Sciences,Branford,CT,USA)使用Roche Titanium協議生成讀數，作為深度生命普查計劃的一部分(http://www.deepcarbon.net/content/deep-life)。每次讀取的開頭和結尾都針對引物堿基進行修剪，并刪除基于熱標簽測序錯誤率評估的可能低質量的序列（Huse等人2007）。使用序列分類的全局比對(GAST)標簽映射方法（Sogin等人2006），其中16S rDNA序列，RefSSU，參考數據庫是基于席爾瓦數據庫（Pruesse等人。2007）。如果三分之二或更多的全長序列共享相同的指定操作分類單元(OTU)，則將標簽分配給該OTU。根據BLAST與任何參考標簽不匹配的標簽不會被賦予分類學分配。

方法論和圖書館建設的更多細節可以在別處找到（Marteinsson et al.2013）。通過稀疏分析測試序列的代表性，并使用Chao指數估計OTU豐富度。為了統計估計每個樣品的豐度和均勻度，計算了香農指數和辛普森指數。使用Morsita-Horn算法進行序列相似性的距離計算。生成的數據已提交給NCBI序列讀取存檔(SRA)，登錄號為SRX268395和SRX268398–SRX268402。使用BLAST針對GenBank核苷酸數據庫搜索出現在大約3%或更高頻率豐度的序列，并登記最接近匹配的樣本位點。使用BioEdit 7.1.3.0(Tom Hall,Ibis Biosciences,Carlsbad,CA,92008)比對這些序列，并分析樣品之間序列的同一性。

生物信息學和統計分析

使用微生物種群結構的可視化和分析(VAMPS)網站(評估了454個數據www.vamps.ml.edu)。數據圖形設計和統計分析在Statistica 10(Statsoft,Tulsa,OK,USA)中進行。

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