Cu2+對(duì)NH4+-N、NO3變化的影響?-N、NO2號(hào)?-N、和SOP在一個(gè)周期內(nèi)

圖2a中的數(shù)據(jù)表明，在一個(gè)厭氧-低溶解氧循環(huán)中，對(duì)照反應(yīng)器中NH4+-N的變化與添加Cu2+的反應(yīng)器中的變化幾乎相同，表明Cu2+對(duì)硝化作用沒(méi)有明顯影響（p>0.05）。還發(fā)現(xiàn)，在Cu2+濃度為100μg/L時(shí)，SOP的平均釋放和吸收分別為54.8和66.1 mg/L，幾乎與對(duì)照試驗(yàn)中觀(guān)察到的結(jié)果相同（54.3和65.4 mg/L）（圖2b）。如圖2所示，兩種NO2?-N和NO3?-在厭氧階段未檢測(cè)到氮，但在低溶解氧階段，其濃度隨時(shí)間增加。在整個(gè)低溶解氧期間，NO3的濃度沒(méi)有顯著差異?-氮在兩個(gè)反應(yīng)器之間（p>0.05），但添加100μg/L的Cu2+會(huì)引起NO2?-氮積累量比對(duì)照低38.9%。Catalan Sakairi等人（1997）還發(fā)現(xiàn)，將Cu2+添加到60μg/L的濃度可以最小化NO2?-海水生物脫硝過(guò)程中氮的積累，但其機(jī)理尚未討論。在本研究中，降低NO2的原因?-在接下來(lái)的文本中討論了添加Cu2+的反應(yīng)器中低溶解氧階段的氮積累。

Cu2+對(duì)PHA、糖原和SOP轉(zhuǎn)化及活性污泥生長(zhǎng)的影響

在厭氧-低溶解氧BNR過(guò)程中，在厭氧期間觀(guān)察到SOP釋放、PHA合成和糖原降解，在隨后的低溶解氧階段，PHA被氧化以吸收磷、反硝化、細(xì)胞生長(zhǎng)和補(bǔ)充糖原。從表2可以看出，兩種SBR之間PHA和SOP的轉(zhuǎn)化和細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異（p<0.05）。顯然，磷累積生物的活性不受Cu2+添加的影響。然而，添加Cu2+導(dǎo)致厭氧或低溶解氧階段的糖原轉(zhuǎn)化比對(duì)照低約25%。

表2添加100μg/L Cu2+對(duì)厭氧-低DO BNR過(guò)程中PHA、SOP和糖原轉(zhuǎn)化以及活性污泥生長(zhǎng)的影響

銅離子對(duì)反硝化酶活性的影響

反硝化是一種包含四個(gè)步驟的金屬酶途徑（電子補(bǔ)充材料，圖S8）。NO3號(hào)?還原酶（NAR），NO2?還原酶（NiR）、NO還原酶（NOR）和N2O還原酶（N2OR）是反硝化的四個(gè)關(guān)鍵酶。眾所周知，亞硝酸鹽和N2O的積累分別取決于硝酸鹽和亞硝酸鹽還原以及NO和N2O還原的相對(duì)速率（NO3?→NO2號(hào)?→不→氧化亞氮→N2）。如圖3a所示，與對(duì)照組的0.367 mg N/g MLVSS/min相比，在100μg/L的Cu2+濃度下，NiR活性增加到0.72 mg N/g MLVSS/min，而NAR活性與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著影響（0.49 mg N/g MLVSS/min與0.45 mg N/g MLVSS/min）（圖3b）。因此，Cu2+的加入顯著增強(qiáng)了亞硝酸鹽的還原，從而減少了NO2?積累隨著Cu2+的加入，N2OR的活性從0.047（對(duì)照組）增加到0.124 mg N/g MLVSS/min（圖3a），而NOR的活性幾乎與對(duì)照組相同（0.244對(duì)0.264 mg N/g MLVSS/min）（圖3b）。因此，很容易理解，當(dāng)添加100μg/L的Cu2+后，N2OR的活性提高2.63倍時(shí)，N2O的生成大大降低。

Cu2+對(duì)活性污泥中反硝化菌群落的影響

nirS、nirK和nosZ基因在編碼反硝化過(guò)程中的關(guān)鍵酶（如亞硝酸鹽還原酶和氧化亞氮還原酶）中起著至關(guān)重要的作用，這些酶可以催化NO2的還原?到NO，最后到N2（Tavares等人，2006年）。因此，根據(jù)文獻(xiàn)（Geets等人2007年；Henry等人2006年），針對(duì)nirS、nirK和nosZ基因的定量實(shí)時(shí)PCR分析可用于確定反硝化細(xì)菌的豐度。圖4說(shuō)明了添加Cu2+后nirS、nirK和nosZ基因拷貝的變化。觀(guān)察到，添加Cu2+后，nirS和nirK基因拷貝數(shù)分別從6.07×106和1.17×106拷貝/g MLVSS增加到6.91×106和1.32×106拷貝/g MLVSS，表明本研究中的反硝化菌數(shù)量通過(guò)添加低劑量的Cu2+顯著增加（p<0.05）。對(duì)照和添加Cu2+的反應(yīng)器中的nosZ拷貝數(shù)分別為7.66×106和9.03×106拷貝/g MLVSS（圖3）。顯然，在添加100μg/L Cu2+后，負(fù)責(zé)N2O還原的反硝化菌數(shù)量顯著增加（p<0.05）。

圖3 Cu2+（100μg/L）對(duì)NiR和N2OR（a）以及NAR和NOR（b）活性的影響。誤差條表示三種不同測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖4 Cu2+對(duì)nosZ、nirS和nirK基因拷貝的影響。誤差條表示三種不同測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差

另外兩種BNR工藝在城市污水處理過(guò)程中通過(guò)控制Cu2+濃度減少N2O排放的可行性

在另兩種由實(shí)際城市廢水供給的BNR工藝（AAA SBR和MAAA SBR）中，研究了Cu2+對(duì)減少N2O排放的影響。在A(yíng)AA SBR和MAAA SBR中TN和TP的去除效率以及N2O的生成相對(duì)穩(wěn)定后，報(bào)告了數(shù)據(jù)（見(jiàn)表3）。

表3其他兩種BNR SBR中N2O生成和NH4+-N、TN和TP去除效率的比較

在A(yíng)AA-SBR和MAAA-SBR的對(duì)照反應(yīng)器中，生成的N2O去除率分別為0.830和0.559 mg N/mg N，當(dāng)Cu2+濃度為10μg/L時(shí)，去除率分別降至0.595和0.267 mg N/mg N，TN去除率分別從60.6%提高到67%（p<0.05）和61.7%提高到65.8%（p<0.05）。Cu2+從10μg/L增加到100μg/L后，N2O的生成量分別降低到0.533（AAASBR）和0.137 g/L（MAAA-SBR），TN去除效率沒(méi)有顯著影響（p<0.05）。從表3可以看出，與對(duì)照組相比，添加10或100μg/L的Cu2+不會(huì)顯著影響NH4+-N和TP的去除效率。當(dāng)采用厭氧-低溶解氧BNR工藝處理廢水時(shí)，所有這些觀(guān)察結(jié)果幾乎與上文討論的結(jié)果相同。因此，可以得出結(jié)論，通過(guò)將廢水Cu2+濃度控制在10至100μg/L，減少城市污水生物處理過(guò)程中N2O的生成是可行的。

討論

據(jù)報(bào)道，反硝化菌stutzeri會(huì)產(chǎn)生缺乏銅的非活性N2O還原酶（Mokhele等人，1987年）。研究還發(fā)現(xiàn)，與缺銅培養(yǎng)物相比，增加斯圖澤里梭菌和反硝化副球菌培養(yǎng)物中的Cu2+濃度導(dǎo)致N2O氣體積累減少和生長(zhǎng)加速（Granger和Ward 2003）。從本研究中可以看出，通過(guò)將Cu2+濃度控制在10–100μg/L，不僅可以顯著減少厭氧-低溶解氧生物廢水處理過(guò)程中N2O的生成54.4–72.4%，而且可以提高TN的去除效率，而不會(huì)對(duì)NH4+-N和TP的去除產(chǎn)生不利影響。然而，正如在其他研究中觀(guān)察到的那樣，過(guò)量的Cu2+（5000μg/L）對(duì)BNR微生物有毒（Ganesh等人，2010年；Wu和Rodgers，2010年）。根據(jù)美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（2010）的研究，在較低的pH值（<6.5）下，游離銅的毒性水平可能會(huì)抑制硝化作用，在較高的pH值（7–8）下，痕量游離銅（100μg/L是最佳濃度）可能會(huì)加速硝化作用。在本研究中，pH值在7到8之間變化（電子補(bǔ)充材料，圖S9）。因此，當(dāng)前研究中10–100μg/L的Cu2+的存在應(yīng)有利于硝化。然而，未觀(guān)察到Cu2+對(duì)硝化的加速作用，可能是因?yàn)閷?duì)照SBR中的氨氮去除效率高達(dá)97%。

數(shù)據(jù)（圖1和2b）表明，當(dāng)只有少量NO2累積時(shí)，SBR中N2O的排放率在有氧期的第一個(gè)小時(shí)內(nèi)較低（低于0.1μmol/min）（SBR#5除外）?-檢測(cè)到N。然后，在接下來(lái)的1.5小時(shí)內(nèi)，隨著NO2的積累，N2O的排放速率增加?-N、一些研究人員報(bào)告說(shuō)，NO2的積累?-由于亞硝酸鹽或亞硝酸鹽形成的HNO2的毒性抑制了N2O向N2的還原反應(yīng)，氮在生物脫氮過(guò)程中誘導(dǎo)了N2O的積累（Itokawa等人，2001年；Zhou等人，2008年）。亞硝酸鹽積累也被認(rèn)為是自養(yǎng)硝化菌反硝化的原因，其最終產(chǎn)物是N2O（Kampschreur等人，2007年）。據(jù)報(bào)道，pH值是影響N2O生成的另一個(gè)重要因素。Th?rn和S?rensson（1996）發(fā)現(xiàn)，pH值高于6.8時(shí)，缺氧活性污泥中不會(huì)形成N2O。當(dāng)pH值在5到6之間時(shí)，N2O產(chǎn)生量最大。在當(dāng)前研究中，添加Cu2+（100μg/L）的SBR在一個(gè)循環(huán)中的pH變化與對(duì)照SBR中的pH變化幾乎相同（電子補(bǔ)充材料，圖S9）。因此，影響N2O排放的因素，包括溶解氧、pH、COD/N、SRT和溫度，在六種SBR中是相同的，這表明NO2的減少?在低溶解氧階段通過(guò)添加Cu2+積累是降低N2O生成的重要原因。

形成亞硝酸銅還原酶催化中心的銅離子已在大量反硝化菌中被報(bào)道（Tavares等人，2006），其耗盡可抑制亞硝酸鹽還原酶的合成（Zumft 1997）。如本研究所示，在活性污泥處理廢水過(guò)程中，添加Cu2+可以顯著提高NiR活性，從而減少NO2?反硝化累積。

在本研究中，觀(guān)察到在污泥濃度（MLSS）約為3200 mg/L的厭氧-低溶解氧BNR工藝處理廢水期間，添加Cu2+可提高N2OR活性，在Cu2+濃度為100μg/L時(shí)觀(guān)察到其最大活性（電子補(bǔ)充材料，圖S10）。N2OR是一種含雙核電子轉(zhuǎn)移位點(diǎn)CuA和催化位點(diǎn)CuZ的銅蛋白（Pomowski等人，2011年）。CuA中心被認(rèn)為接受來(lái)自電子供體（c型細(xì)胞色素和/或假天青蛋白）的電子，并將其轉(zhuǎn)移到N2OR蛋白質(zhì)另一亞單位的相鄰CuZ位點(diǎn)，其中N2O結(jié)合并還原為N2和水（Pomowski等人，2011）。銅離子是純反硝化細(xì)菌N2O還原酶生物合成的控制因素（Iwasaki等人，1980年），銅離子缺乏會(huì)導(dǎo)致反硝化污泥的N2OR活性非常低（Miller等人，2009年）。因此，觀(guān)察表明，當(dāng)添加適量的Cu2+時(shí)，較高的N2OR活性會(huì)導(dǎo)致BNR過(guò)程產(chǎn)生較少的N2O。

對(duì)活性污泥中nosZ、nirS和nirK基因的實(shí)時(shí)定量分析表明，添加Cu2+促進(jìn)了反硝化菌的生長(zhǎng)。Pieja等人（2011年）報(bào)告稱(chēng)，含有甲烷單加氧酶（一種需要銅的酶）的I型甲烷諾菌的生長(zhǎng)可以通過(guò)降低培養(yǎng)基中的Cu2+濃度來(lái)限制。Granger和Ward的研究表明，當(dāng)以N2O為基質(zhì)時(shí)，純反硝化細(xì)菌反硝化細(xì)菌在富銅培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率是在缺銅培養(yǎng)基中的6倍。這些結(jié)果表明，銅離子可能是銅依賴(lài)性細(xì)菌生長(zhǎng)的一個(gè)必要因素。還觀(guān)察到，一些反硝化菌不包含編碼N2O還原酶的基因，例如根癌農(nóng)桿菌C58，這些反硝化菌的最終產(chǎn)物是N2O（Baek等人，2008）。因此，NO2的減少?通過(guò)添加Cu2+積累N2O不僅是由于較高的NIR和N2OR活性，而且還直接受到反硝化菌數(shù)量增加的影響，尤其是能夠還原N2O的反硝化菌。

表2中的數(shù)據(jù)表明，在低溶解氧階段，用于糖原合成的PHA消耗較少，而用于反硝化的PHA節(jié)省較多，這導(dǎo)致添加Cu2+的反應(yīng)器中的TN去除效率高于對(duì)照反應(yīng)器（60.6%對(duì)70.8%）。通過(guò)添加Cu2+改善TN去除的另一個(gè)原因是參與反硝化反應(yīng)的關(guān)鍵酶和微生物增加（圖3）。據(jù)報(bào)道，糖原積累生物（GAO）90%的反硝化最終產(chǎn)物是N2O，這是導(dǎo)致BNR過(guò)程中N2O排放增加的主要原因（Lemaire等人，2006；Meyer等人，2005；Zeng等人，2003）。曾等（2003）指出，在BNR系統(tǒng)中，糖原的轉(zhuǎn)化越少，GAO的活性越弱。因此，結(jié)果表明，銅離子可能會(huì)抑制GAO的活性（見(jiàn)表2），這可能是添加銅的反應(yīng)器中產(chǎn)生較低N2O的另一種可能機(jī)制。

在文獻(xiàn)中，當(dāng)研究生物脫氮除磷時(shí)，合成廢水或城市廢水中的Cu2+濃度通常低于10μg/L（Buzier等人，2006；Zeng等人，2003）。根據(jù)本研究結(jié)果，從控制N2O排放和促進(jìn)總氮去除的角度來(lái)看，BNR工藝進(jìn)水中的Cu2+濃度始終不足。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，約98.6%的進(jìn)水Cu2+被去除，出水中的Cu2+含量低于2μg/L。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（2007）指出，公有處理廠(chǎng)排放濃度為40-200μg/L的Cu2+不應(yīng)對(duì)水生物種構(gòu)成威脅。

在通過(guò)厭氧-低溶解氧工藝處理廢水的過(guò)程中，氮的去除會(huì)經(jīng)歷硝化作用（NH4+-N被氧化為NO2?-N和NO3?-N）和脫氮（NO2?和NO3?還原為NO、N2O和N2），銅的添加顯著影響反硝化作用。此外，本研究表明，銅離子作為一種微量元素，在生物城市污水脫氮除磷過(guò)程的反硝化活性（NiR和N2OR）和群落中起著重要作用，適當(dāng)?shù)你~添加可以顯著減少N2O的生成，同時(shí)提高生物脫氮過(guò)程中的總氮去除率。

致謝

本研究得到了國(guó)家863計(jì)劃（2011AA060903）和污染控制與資源再利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的資助。