3.3 CHT對(duì)反硝化酶、基因豐度和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

為了確定CHT對(duì)反硝化酶活性的影響，評(píng)估了四種反硝化還原酶（NAR、NIR、NOR和NOS）的活性（Saggar等人，2013）。如圖3a和b所示，對(duì)照處理和CHT處理在NAR活性方面沒(méi)有顯著差異。對(duì)照組的NIR活性顯著高于C25處理組（P＜0.01）。這與NO2的變化是一致的?在本研究中，這表明CHT顯著抑制NO2?還原過(guò)程，產(chǎn)生NO2?高濃度CHT的累積。與對(duì)照組相比，C25處理組的NOR活性顯著降低29.4%（P＜0.05），而C5和C10處理組的NOR活性無(wú)顯著差異。此外，高CHT添加處理（C10、C25）的NOS活性也顯著降低（P b 0.01），C25處理的NOS活性比對(duì)照（C0）下降80.3%。從結(jié)果來(lái)看，NOS活性的下降大于NOR活性的下降，這表明C25處理中NOS活性的顯著抑制可能導(dǎo)致CHT施用后N2O排放量增加。鄭等人（2014b）還發(fā)現(xiàn)，大量N2O排放與相應(yīng)的反硝化還原酶活性抑制有關(guān)。如上所述，CHT對(duì)NIR、NOR和NOS活性的顯著抑制可能是CHT對(duì)反硝化過(guò)程產(chǎn)生負(fù)面影響的原因。

圖3.百菌清（CHT）對(duì)反硝化過(guò)程中NAR（a）、NIR（b）、NOR（c）和NOS（d）活性的影響。數(shù)據(jù)顯示為三次獨(dú)立測(cè)量的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差。Tukey t檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比，*P b 0.05，**P b 0.01。

作為反硝化基因表達(dá)的產(chǎn)物，反硝化還原酶活性與反硝化基因豐度相關(guān)。由于CHT對(duì)反硝化的抑制是一個(gè)劑量反應(yīng)過(guò)程，因此NO3存在顯著差異?C0和C25處理之間的減少和N2O排放。因此，本研究選擇CHT對(duì)C0和C25處理下反硝化基因豐度的影響進(jìn)行研究。如圖S3所示，功能基因narG、nirS、nirK、norB和nosZ的拷貝數(shù)在104到107拷貝之間?1干燥土壤。對(duì)照組或CHT處理中narG基因的拷貝數(shù)高于其他四個(gè)基因的拷貝數(shù)。這一結(jié)果與之前的研究一致，之前的研究報(bào)告表明，narG基因在大多數(shù)自然土壤中的豐度最高（李等，2017；張等，2016）。對(duì)照處理的nirS、nirK和norB基因豐度分別為5.06×104、4.20×104和4.65×104?1干土。與之前研究中報(bào)告的基因豐度相比（Henry等人，2006），本研究中的nirS、nirK和norB基因豐度明顯較低。這可能與實(shí)驗(yàn)土壤中反硝化細(xì)菌豐度的差異有關(guān)。值得注意的是，本研究中的nirS基因拷貝數(shù)低于nirK基因拷貝數(shù)，這與之前的研究不一致（Shrewsbury等人，2016）。nirS和nirK基因之間豐度的差異可能取決于土壤性質(zhì)，如pH值、養(yǎng)分和土壤銅（Cu）含量（Enwall等人，2010）。我們的結(jié)果表明，本研究中的茶園土壤比nirS基因更適合nirK基因，并且可以促進(jìn)nirK基因豐度的增加。此外，thenosZ基因的拷貝數(shù)（約105個(gè)拷貝）為?1干土）與之前研究（Henry等人，2006）中測(cè)量的其他自然土壤相似，比nirK、nirS和norB基因的拷貝數(shù)大一個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖4顯示，CHT添加降低了反硝化菌中的基因豐度，但程度不同。方差分析顯示，對(duì)照組之間的差異不顯著（1.81×107μg）?1干土）和C25處理（1.76×107 g?1干土）的narG基因數(shù)據(jù)。然而，與對(duì)照處理相比，CHT處理的nirK、nirS和norB基因豐度分別下降了31.6%、22.1%和12.7%。CHT處理中nirK（P b 0.05）和nirS（P b 0.05）基因豐度的顯著降低可能導(dǎo)致反硝化菌中NIR活性的降低，這可能是NO2累積的另一個(gè)原因?.C25處理的nosZ基因拷貝數(shù)為2.47×105拷貝?1干土，與對(duì)照處理（5.01×105拷貝）相比減少了50.7%?1干土）（P b 0.01）。nosZ基因豐度的降低可能導(dǎo)致NOS活性的降低，這將顯著抑制從N2O到N2的減少。nosZ基因豐度的降低（50.7%）遠(yuǎn)高于norB基因豐度的降低（12.7%），這表明CHT對(duì)N2O消耗的抑制作用比N2O產(chǎn)生的抑制作用強(qiáng)得多，導(dǎo)致N2O排放量顯著增加。

圖4.百菌清（CHT）對(duì)對(duì)照組和25 mg kg體重組narG、nirS、nirK、norB和nosZ的相對(duì)基因豐度的影響?1 CHT處理。Tukey t檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比，*P b 0.05，**P b 0.01。

從對(duì)照和CHT處理中獲得的細(xì)菌在門和類群水平上的分類學(xué)如圖S4所示。厚壁菌、放線菌、氯屈曲菌和變形菌在兩種處理中占優(yōu)勢(shì)。與對(duì)照處理相比，CHT處理后厚壁菌和放線菌的相對(duì)豐度分別從81.6%和9.4%下降到80.9%和5.2%。在類別水平上，在C0和C25處理中均檢測(cè)到α、β、γ和δ-變形菌，在之前的研究中，據(jù)報(bào)告這些變形菌與氮循環(huán)過(guò)程有關(guān)（王等人，2016）。從C0到C25處理，α、β和δ變形菌的豐度分別下降了2.3%、0.04%和0.1%。兩種處理中檢測(cè)到的前25個(gè)屬如圖S5所示。芽孢桿菌作為自然系統(tǒng)中潛在反硝化的貢獻(xiàn)者和nosZ基因的持有者（Verbaendert等人，2011），在CHT處理后從9.8%下降到8%。如上所述，對(duì)照和C25處理之間的微生物群落沒(méi)有明顯變化。這表明CHT的應(yīng)用可能不會(huì)通過(guò)改變微生物群落來(lái)影響反硝化過(guò)程，但可能會(huì)影響微生物的細(xì)胞內(nèi)代謝。測(cè)定ETSA值和ATP含量以評(píng)估CHT對(duì)微生物代謝過(guò)程的影響。

3.4 CHT對(duì)反硝化相關(guān)代謝過(guò)程的影響

反硝化菌接受來(lái)自有機(jī)物代謝過(guò)程和電子傳輸鏈的電子，以完成反硝化過(guò)程（Chen和Strous，2013）。碳源代謝和電子傳遞過(guò)程與反硝化過(guò)程密切相關(guān)。因此，通過(guò)測(cè)量ETSA值和ATP含量來(lái)確定CHT對(duì)這兩個(gè)過(guò)程的影響。如圖5a所示，ETSA值為0.186μgO2·mg?1蛋白質(zhì)·min?C0為1，C5、C10和C25分別下降了34.9%、43.5%和46.7%，這表明較高的CHT應(yīng)用可以大大降低ETSA值。對(duì)照組和低CHT濃度（C5）之間的ETSA值沒(méi)有顯著差異。同時(shí)，高濃度CHT（C10（P b 0.05）、C25（P b 0.05））顯著抑制電子傳遞系統(tǒng)。此前的一項(xiàng)研究還報(bào)告稱，ETSA值的降低與反硝化過(guò)程的抑制有關(guān)（Wan等人，2016年）。C25處理中ETSA值最低的記錄表明CHT對(duì)電子傳輸過(guò)程有抑制作用，這將導(dǎo)致反硝化過(guò)程中可用的電子更少。

圖5.對(duì)照組和百菌清（CHT）處理（5、10和25 mg kg）中電子傳遞系統(tǒng)活性（ETSA）（a）、三磷酸腺苷（ATP）含量（b）的值?1）72小時(shí)后，誤差條表示三次試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。Tukey t檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比，*P b 0.05，**P b 0.01。

圖5b表明，土壤中的ATP含量將隨著CHT濃度的增加而降低。ATP濃度為8.86 nmol g?1，但顯著下降至4.63和2.85 nmol g?分別在C10（P b 0.05）和C25（P b 0.01）處理中為1。ATP被廣泛認(rèn)為是參與細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)移的貨幣單位，可以在碳源代謝和電子傳遞鏈中產(chǎn)生（Knowles，1980）。Hammes等人（2010年）報(bào)告說(shuō)，ATP可能是微生物生存能力的有用指標(biāo)。在本研究中，對(duì)照治療中的ATP濃度與之前研究中報(bào)告的相似（邱等人，2016）。對(duì)于C25處理，ATP濃度的降低可能表明CHT對(duì)微生物活性具有抑制作用，例如碳源代謝以及電子傳輸和消耗過(guò)程（Junge和Nelson，2015）。結(jié)合ETSA值和ATP含量的結(jié)果，CHT應(yīng)用將抑制電子傳輸過(guò)程。因此，到脫氮過(guò)程的有限電子傳輸可能是CHT應(yīng)用后抑制脫氮過(guò)程的一個(gè)因素。

3.5土壤反硝化作用與分子指標(biāo)的關(guān)系

盡管3號(hào)?還原過(guò)程和相關(guān)還原酶活性已由之前的研究確定，我們對(duì)NO3之間關(guān)系的理解?去除過(guò)程和還原酶活性仍不清楚。因此，建立了線性關(guān)系，將反硝化過(guò)程與分子指標(biāo)聯(lián)系起來(lái)，以便更好地在分子水平上理解反硝化過(guò)程。

通過(guò)相關(guān)分析建立了反硝化作用與分子指標(biāo)之間的關(guān)系（表S3）。一些關(guān)鍵相關(guān)性如圖6所示。如圖6a所示，NO3?-氮去除率與NAR活性呈正相關(guān)，因?yàn)镹AR可以減少NO3?至NO2?.最終NO2-N濃度與NAR和NIR活性呈負(fù)相關(guān)（圖6b），NIR和最終NO2的擬合線斜率?-氮濃度大于NAR和最終NO2的濃度?-氮濃度。這種關(guān)系表明CHT對(duì)NO2的抑制作用?還原過(guò)程大于NO2上的還原過(guò)程?導(dǎo)致NO2累積的生產(chǎn)過(guò)程?.同樣，最終N2O濃度與NOR和NOS活性呈負(fù)相關(guān)（圖6c）。根據(jù)相關(guān)分析數(shù)據(jù)（表S3），NOS的相關(guān)系數(shù)(?0.968）高于NOR(?0.920）與N2O濃度相關(guān)。這表明NOS活性對(duì)CHT比NOR活性更敏感。因此，NOS活性的降低是導(dǎo)致N2O積累的關(guān)鍵因素。至于微生物活性指標(biāo)，圖6d和e表明，ATP含量與四種反硝化酶的活性呈正相關(guān)，表明反硝化過(guò)程的抑制可能是由于微生物代謝的下降。ETSA值與NOR和NOS活性顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明，電子傳遞的減少可能是CHT對(duì)反硝化產(chǎn)生急性抑制作用的另一個(gè)原因。

圖6.反硝化酶活性與NO3之間的線性關(guān)系?-N去除率（a）；NO2號(hào)?-氮濃度（b）；N2O-N濃度（c）；三磷酸腺苷（ATP）含量（d）（e）；和電子傳輸系統(tǒng)活性（ETSA）值（f）。

3.6環(huán)境意義

近幾十年來(lái)，全球茶園面積顯著增長(zhǎng)，從2002年（265萬(wàn)公頃）到2014年（437萬(wàn)公頃），增長(zhǎng)了64.9%。茶園區(qū)域的反硝化過(guò)程令人擔(dān)憂，因?yàn)樗鼤?huì)產(chǎn)生溫室氣體N2O。我們的結(jié)果表明，將CHT的施用量從0增加到25 mg kg?1抑制NO3?去除效率從83.8%提高到54.1%，但N2O排放量增加了94.8%。當(dāng)533.4 kgN hm時(shí)?在茶園區(qū)域施用2%的氮肥和5 mg kg?大田施用CHT 1，年N2O-N排放量增加3.0×106kg，年未還原NO3量增加?-氮保持在5.48×108 kg。因此，CHT在茶園土壤上的應(yīng)用將對(duì)全球氣候產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致更多的NO3?從土壤中滲入水中，導(dǎo)致富營(yíng)養(yǎng)化加劇。雖然施用CHT會(huì)增加茶園土壤反硝化過(guò)程中的N2O排放，但也應(yīng)考慮通過(guò)CHT控制茶樹(shù)病害。今后，應(yīng)嚴(yán)格限制農(nóng)藥的施用量，以平衡害蟲控制和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

4、結(jié)論

在72小時(shí)的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中，研究了CHT對(duì)茶園土壤的急性影響。結(jié)果表明，CHT的應(yīng)用導(dǎo)致了NO3的減少?去除效率、NO2積累?,以及N2O排放量的增加。CHT的施用抑制了反硝化酶的活性，降低了反硝化基因的豐度。此外，本研究表明，CHT應(yīng)用導(dǎo)致ETSA和ATP含量降低。需要進(jìn)一步研究以確定CHT對(duì)土壤反硝化的慢性影響及其代謝產(chǎn)物對(duì)土壤健康的潛在毒性。

致謝

本研究得到了中央高校基礎(chǔ)研究基金（編號(hào)：106112017CDJXY210005、106112017CDJQJ218843）的資助。我們還感謝弗雷德里克·庫(kù)隆教授和匿名評(píng)論員對(duì)本手稿的早期草稿提出的建設(shè)性建議和意見(jiàn)。