材料和方法

菌株。 脫色鏈球菌菌株S12T（CCTCC M203093T=IAM 15094T）是從紡織印染廢水處理廠的活性污泥中分離出來的，并在我們的實驗室保存。20,21該菌株可以使用莧菜紅（圖S1，支持信息）或鐵（III） 作為電子受體并在MFC的陽極上形成生物膜。9,20,21來自Luria的單一菌落菌株S12 ? 選取Bertani（LB）平板并將其接種到滅菌的LB肉湯中，培養物在30°C下有氧培養過夜。通過離心（6000g）將細胞與培養物分離2分鐘，然后使用滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌兩次以去除殘余營養物。 洗滌后的細胞用作MFC的接種物。

MFC和操作。 如前所述組裝雙室MFC。使用9塊普通石墨板（2 cm×3 cm×0.2 cm）作為陽極和陰極。 使用Ag/AgCl電極（+0.197 V vs標準氫電極）作為陽極的參比電極。 陽極室和陰極室用一塊Nafion 115膜（7.1 cm2）隔開。 組裝和滅菌（115°C 20 min）后，向陽極室（120 mL）中填充100 mL LM培養基（12.8 g/L Na2HPO4、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1.0 g/L NH4Cl和10 mM乳酸，pH 6.8）。 為了刺激生物膜生長，向培養基中添加0.05%（w/v）的酵母抽提物。 除非另有說明，否則將不同濃度的偶氮染料莧菜紅（0、2、5、7和10 mM）作為替代電子受體添加到陽極室中。 陰極電解質含有100毫升PBS和50毫米鐵氰化鉀。 在接種（2%，v/v）后，用N2鼓泡陽極室以去除頂空空氣和溶解氧，然后用橡膠塞密封。 MFC在30°C下運行，外部電路閉合，包括1000Ω外部電阻器。 一組相同數量的斷路MFC與正常厭氧（NA）控制反應器并聯運行。 含有不同濃度莧菜紅的非生物反應器也用于評估莧菜紅的效果和可能的電化學還原。 使用數據記錄器（Keithley 2700，模塊7702）監測電流生成。 在每種實驗條件下，反應器分三次運行。

化學和生理分析。 如前所述，在520 nm處的吸收用于監測莧菜紅濃度的變化。如前所述，20,21蛋白質含量被量化，以評估浮游細胞和生物膜的細胞生長，因為偶氮染料因其紅色和對細胞分裂的抑制作用，可干擾光學分析和菌落計數。9 共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）用于分析生物膜結構和細胞活性 ? 24在CLSM分析之前，對陽極上的生物膜進行取樣，并將其浸入已滅菌的PBS中，以去除松散附著在生物膜上的浮游細胞或碎屑。 然后用活/死BacLight染色試劑盒（分子探針，Invitrogen）對樣品進行染色，并在CLSM（LSM 700，蔡司）下觀察。 染色試劑盒是基于細菌膜滲透性開發的，通常用于區分高（綠色）或低（紅色）生長活性的細菌，而不是確定細胞是活的還是死的。觀察并分析每個陽極生物膜的25個隨機取樣視野。 為了獲得三維（3D）結構信息，在Zen軟件（蔡司）的“堆棧”模型下觀察生物膜樣品。 分析每個生物膜層的比活力，并根據像素計數將其表示為活細胞與總生物膜細胞的比率。9,22生物膜樣品的總活力是每個生物膜層的平均活力。

微電極分析。 在莧菜紅耗盡之前，使用微電極系統（丹麥Unisense）（圖S2，支持信息）測定散裝液體和陽極生物膜內的溶解氧、pH值和氧化還原電位分布。26,27在分析之前， 將MFC陽極室的橡膠塞更換為parafilm，通過parafilm插入微電極（尖端直徑25μm），并使用SensorTrace Pro（v.3.2.7）軟件朝陽極表面下壓。 使用顯微鏡（300×超級眼）監測微電極尖端的位置。

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