研究簡介:腫瘤微環境的酸度從根本上影響癌癥和基質細胞的功能、它們的相互作用以及形成惡性進展的選擇壓力和適應過程。腫瘤微環境的酸堿組成對預后預測和新治療方法的開發具有相當大的前景，但我們仍然缺乏合理設計靶向干預措施的機制洞察力。CA9還具有至少部分獨立于其碳酸酐酶活性的促癌作用，涉及細胞粘附功能，并且可能受到細胞外結構域脫落的影響。盡管CA9和CA12是乳腺癌的預后標志物和擬議的藥理學靶點，但這些和其他碳酸酐酶對特定乳腺癌分子亞型的影響仍不清楚。在代謝和增殖活性、免疫原性和潛在致癌途徑不同的腫瘤中，碳酸酐酶如何影響癌細胞和基質細胞（包括脈管系統和免疫系統）之間的相互作用。離體腫瘤脈管系統和免疫細胞功能的酸堿依賴性變化是顯著的，但它們在腫瘤微環境中的后果需要進一步研究。實體癌組織內明顯的擴散限制——結合碳酸酐酶活性的局灶性積累和pH介導的酸堿轉運蛋白變構調節—導致從根本上影響腫瘤生物學的分隔pH動力學。因此為了解決碳酸酐酶在致癌和癌癥進展過程中的功能貢獻，在體內或在保持逼真的3維結構和相關基質成分的離體條件下研究癌組織至關重要。在這里研究人員通過以下方式實現這一目標：研究從人類和小鼠乳腺癌組織和匹配的正常乳腺組織中新鮮分離的類器官中碳酸酐酶的表達和功能；在小鼠乳腺癌模型中的體內研究，以及評估與臨床和病理信息相結合的人體體積和單細胞轉錄組數據。

Unisense微電極分析系統的應用

首先向荷瘤小鼠腹膜內注射50 mg/kg乙酰唑胺或載體來評估體內急性碳酸酐酶抑制的pH值后果。然后5分鐘后，小鼠注射氯胺酮和甲苯噻嗪以誘導麻醉。老鼠被放在加熱墊上；總共30分鐘后，通過一個小切口暴露腫瘤，并使用玻璃微電極（pH-500；Unisense，丹麥），以記錄進入腫瘤的1毫米步進過程中的pH值。參比電極放置在腹腔內。報告了腹膜表面、腫瘤4毫米深度以及遇到的酸性最強的腫瘤位置（表示為腫瘤“核心”）的pH值。

實驗結果

碳酸酐酶——尤其是細胞外亞型CA4、CA6、CA9、CA12和CA14——在人類和小鼠乳腺癌發生過程中發生了強烈的表達變化。在基底樣/三陰性乳腺癌患者中，細胞外碳酸酐酶表達升高對生存有負面預測，而令人驚訝的是，細胞外碳酸酐酶對HER2/ErbB2富集乳腺癌患者的生存有積極預測。碳酸酐酶抑制減弱細胞凈酸排出和細胞外H+從人和小鼠乳腺癌組織的擴散受限區域到外周和灌注良好區域的消除。在體內提供的碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺可酸化ErbB2誘導的小鼠乳腺癌微環境，限制腫瘤免疫浸潤（CD3+T細胞、CD19+B細胞、F4/80+巨噬細胞），降低炎性細胞因子（Il1a、Il1b、Il6)和轉錄因子(Nfkb1)表達，并加速腫瘤生長。支持碳酸酐酶的免疫調節作用，與富含HER2的乳腺癌細胞外碳酸酐酶高表達相關的患者生存獲益取決于腫瘤炎癥特征。乙酰唑胺可降低乳腺組織和血液中的乳酸水平而不影響乳腺腫瘤灌注，這表明抑制碳酸酐酶可降低發酵糖酵解。碳酸酐酶通過加速癌細胞和間質間隙的凈H+消除來提高乳腺癌中的pH值，在ErbB2/her2驅動的乳腺癌中提高免疫浸潤和炎癥，限制腫瘤生長并提高患者生存率。

圖1、在人類乳腺癌組織中，線粒體CA5A和CA5B在細胞類型中普遍表達，而非線粒體碳酸酐酶亞型在癌癥上皮細胞和內皮細胞中占主導地位，除了CA7僅由癌癥相關的成纖維細胞和骨髓細胞表達。A)總體碳酸酐酶表達強度顯示為t-SNE圖（左）和相應的成簇細胞類型（右）。B)圖顯示了人乳腺癌中碳酸酐酶表達的細胞類型特異性模式。報告的單細胞測序數據涵蓋24489個癌上皮細胞、6573個癌相關成纖維細胞、7605個內皮細胞、35214個T細胞、3206個B細胞和9675個髓樣細胞。數據是從Broad Institute托管的在線單細胞門戶中提取的。C圖顯示了294個乳腺癌樣本中碳酸酐酶的蛋白質表達水平。

圖2、具有已知細胞外表達的碳酸酐酶亞型CA4、CA6、CA12和CA14、具有已知線粒體表達的CA5β和具有已知細胞溶質表達的CA7可積極預測富含HER2的乳腺癌患者的預后。A–L富含HER2的乳腺癌患者(n=358–860)的生存曲線根據每種碳酸酐酶亞型的mRNA表達進行分層。曲線的顏色編碼區分具有已知細胞外或分泌（紅色）、細胞溶質（綠色）和線粒體（藍色）表達的碳酸酐酶亞型。

圖3、碳酸酐酶從根本上改變了乳腺癌組織中的pH動力學，抑制了癌細胞的凈酸排出，并降低了從核心到外周的間質凈H+消除。(A)響應于將CO2應用于不含HEPES緩沖CO2/HCO3的溶液的平均pH曲線；B量化酸化速率。(C)在裝有pH敏感熒光團羧基SNARF-1的類器官的赤道平面上獲取的共聚焦圖像。白色描繪說明了用于量化類器官核心和外圍pH動力學的示例性感興趣區域。DH細胞外（表面）pH動力學響應小鼠ErbB2誘導的急性暴露（D–F）和人類（G+H,)乳腺癌類器官對CO2/HCO3–相對于沒有CO2/HCO3–的初始平均值。圖F顯示了類器官核心和外圍之間的量化pHo差異，以及它們如何被CO2/HCO3和碳酸酐酶抑制修飾。圖H顯示了關于類器官核心和實驗之間pHo差異的類似信息。IN響應小鼠ErbB2誘導的急性暴露的細胞內pH動力學（I–K，n=6–26）和人類（L-N,n=8)乳腺癌類器官對CO2/HCO3–相對于沒有CO2/HCO3–的初始平均值。

圖4、細胞內碳酸酐酶的抑制降低了小鼠ErbB2誘導的乳腺癌組織中細胞凈酸擠出的能力。A在NH 4+前脈沖誘導的細胞內酸化和隨后的恢復過程中，新鮮分離的乳腺癌類器官中pH i的平均曲線(n=6)。使用乙酰唑胺（ATZ，100μM）、4-氨基乙基）苯磺酰胺（AMB，30μM）或等量的DMSO載體進行實驗。面板的右側部分顯示放大的細胞內酸化恢復階段。B凈酸擠出繪制為類器官外圍和核心區域pHi的函數從ErbB2誘導的小鼠乳腺癌組織中新鮮分離(n=6)。C在最大酸化過程中對應于初始pHi恢復階段的固定pH i計算的凈酸擠出(n=6)。

圖5、用乙酰唑胺進行體內治療可酸化小鼠ErbB2誘導的乳腺癌組織的微環境，降低乳酸濃度，并加速腫瘤生長。A）使用pH敏感微電極(n=8)進行的體內pH測量。“核心”被定義為在用電極逐步刺穿期間遇到的酸性最強的區域。在記錄前30分鐘，小鼠已接受腹膜內注射50 mg/kg乙酰唑胺(ATZ)或同等體積的載體。通過重復測量雙向方差分析比較數據。B）示例性事后剖析腫瘤圖像和體內ErbB2誘導的乳腺癌生長曲線，小鼠每天腹腔注射40 mg/kg ATZ與接受等體積載體的小鼠(n=17)相比。將數據擬合為二階多項式函數，并通過額外的平方和F檢驗比較最佳擬合參數。比例尺代表5mm；兩個圖像都以相同的放大倍數顯示。C-H）通過微透析評估的腫瘤糖酵解代謝。在ATZ或載體給藥開始后1小時測量間質或血清[乳酸](C–E)和[葡萄糖](F–H)。

結論與展望

碳酸酐酶催化CO2/HCO3–緩沖反應，對有效的H+流動性、pH動力學和細胞酸堿感應有影響。然而碳酸酐酶對癌癥和基質細胞功能、它們的相互作用和患者預后的綜合影響尚不清楚。研究人員將人類蛋白質組學數據的生物信息學分析以及大量和單細胞轉錄組學數據與臨床病理學和預后信息相結合，使用了unisense微電極系統的pH敏感微電極記錄和基于微透析的代謝物分析，用于實驗性誘發乳腺癌的小鼠腫瘤內的pH分布。乳腺癌是一種高度異質性的疾病。基于受體表達譜（例如，HER2/ErbB2、雌激素、黃體酮）的分層識別在潛在致癌機制和惡性行為中具有重疊特征的分子亞型。因此，這種分類為揭示疾病機制和闡明乳腺癌患者亞群之間可能存在差異的治療結果提供了重要工具。本研究證明了碳酸酐酶有助于清除乳腺癌組織中的酸性代謝物，并且它們的抑制作用會增強腫瘤微環境的酸度。在小鼠ErbB2誘導的和人類HER2富集的乳腺癌中，細胞外碳酸酐酶增加免疫細胞浸潤和細胞因子表達，減緩腫瘤生長，并提高存活率。