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實驗步驟
采樣
除非另有說明，漿果是在2007年6月和7月、2010年和2011年從美國馬薩諸塞州法爾茅斯的Little Sippewissett鹽沼形成的單個潮間帶池中采樣的（北緯41°34′33.01′，西經70°38′21.24′））。2012年9月從Little Sippewissett(41°34'33.52'N,70°38'9.71'W)的第二個水池中采集了用于銀線硫化物捕獲和循環微伏安法的大漿果（直徑約0.5-1厘米）.粉紅色漿果也取自美國馬薩諸塞州伍茲霍爾的彭贊斯角沼澤(41°31′29.95′N,70°41′7.48′W)，并于2011年夏季采集。漿果是從沉積物中收集的——通過篩分（1 mm網孔大小）去除水界面，并在0.2μM過濾除菌的沼澤水中洗滌3次。
SSU rRNA克隆文庫和桑格毛細管測序
將5到10個小聚集體用PCR級水均質化，并使用MoBio PowerSoil試劑盒（MoBio，Carlsbad，CA，USA）提取DNA，采用1分鐘的珠擊步驟代替10分鐘的渦旋步驟進行裂解制造商的協議中概述。如所述，細菌16S rRNA基因和真核18S rRNA基因在97%序列相似性閾值下進行PCR擴增、克隆、測序和聚類到操作分類單元(OTU)支持信息S1中。去重復、嵌合體檢查的16S rRNA基因序列數據的GenBank登錄號是KF512914–KF513148，18S rRNA基因序列數據是KF516997–KF517018。系統發生樹是使用RAxML 7.2.8(Stamatakis,構建的，2006)具有1000個快速引導推斷和GTRGAMMA速率近似，或使用近似最大似然方法(Price等人，2010)的FastTree構建，具有1000個類似SH的支持，GTRCAT 20個速率類別的近似值。
宏基因組測序和分析
宏基因組測序
如所述，通過Roche GS 454 FLX+、Illumina HiSeq和Illumina MiSeq技術對提取的總群落DNA進行測序支持信息S1中。所有質量過濾、未組裝的序列數據均可在NCBI BioProject PRJNA214436的序列讀取存檔(SRA)登錄號SRX332170、SRX332174和SRX332175中獲得。數據也可通過MG-RAST服務器在MG-RAST ID 4454153.3、4517592.3和4516362.3下獲得。在可能的情況下，使用MG-RAST 3.3管道組裝重疊的Illumina MiSeq雙端讀數（250 bp），并使用M5RNA數據庫進行分類，以提供與16S rRNA基因克隆文庫平行的多樣性描述（Meyer等人，2008年）。為了評估多樣性，dsrAB硫循環標記基因的從策劃的構建了隱馬爾可夫模型（HMM）和全長參考樹dsrAB比對（Loy等人，，2009年2009年使用HMMER 3.0和FastTree（Price））等人。,2010)由Phylosift管道實現(Darling et al.,2014)。使用Phylosift管道，使用LAST（Kielbasa掃描Illumina序列讀數，使用等人，2011年）HMMER 3.0與參考標記比對，并使用pplacer置于全長dsrAB系統發育樹上（Matsen等人，2010年）.
宏基因組組裝、基因組分箱和基因組完整性
Roche 454 Titanium和交錯雙端Illumina HiSeq數據使用idba_ud算法1.0.9(Peng共同組裝et al.,2012)。使用來自蛋白質查詢，Desulfobulbus propionicus和Allochromatium vinosum的在這個完整的、組裝的宏基因組數據的核苷酸數據庫上進行了tBLASTn搜索，以確定關鍵的硫循環功能基因。該數據集已作為全基因組散彈槍(WGS)項目存放在DDBJ/EMBL/GenBank中，編號為AVFP00000000。本文描述的版本為AVFP01000000版本。數據也可通過MG-RAST ID 4532235.3下的MG-RAST數據庫獲得。
大于1 kb的重疊群使用描述的涌現自組織圖譜通過四核苷酸頻率合并到基因組中支持信息S1和之前（Dick等人，2009年；Wrighton等人，2012年）中。FigShare(提供了PB-PSB1和PB-SRB1基因組的RAST注釋http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.770903)。該基因組項目草案已作為WGS項目存放在DDBJ/EMBL/GenBank中，登記號為AVFQ00000000和AVFR00000000。本文中描述的版本是版本AVFQ01000000和AVFR01000000。
顯微鏡和nanoSIMS的嵌入和冷凍切片
洗凈的漿果在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中漂洗1分鐘，然后在室溫下固定1小時（4%多聚甲醛，0.5%戊二醛的PBS）。固定后，漿果用PBS洗滌3次，并在冷凍保護劑溶液（PBS中的7.5%蔗糖）中孵育>1小時。然后將漿果轉移到OCT TissueTek（Sakura，CA，USA）并在液氮中快速冷凍之前使其滲透2小時以上。使用直剃刀低溫恒溫器在-20°C下以10μm厚度切片冷凍組織塊。將用于CARD-FISH雜交和表面反射共聚焦顯微鏡的樣品置于Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides（Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）上，而將用于nanoSIMS的樣品置于玻璃圓或氧化銦錫(ITO)涂層玻璃上正方形（Dekas和Orphan，2011年）。
CARD-FISH，成像元素硫包裹體和共聚焦顯微鏡
ARB軟件包的探針設計工具(Ludwig et al.,2004)用于為16S rRNA基因克隆文庫數據中發現的PB-SRB1系統型創建特定探針。使用BLAST、SILVA數據庫（第108版）、核糖體數據庫項目和NCBI數據庫，針對GenBank數據庫檢查了針對該序列簇的探針(SRB-PiBe213)的特異性，并且對于目標簇之外的序列沒有命中檢測到。SRB-PiBe213探針(5'-tcctcctcgcacaaccgc-3')作為偶聯物從Biomers(Ulm,Germany)訂購。檢查通用γproteobacterial探針GAM42a探針序列，發現其靶向PB-PSB1序列。
除了與定制的SRB-PiBe213探針、GAM42A（Manz等人，1992年）和Delta495a-c與競爭對手ac（Lücker等人，2007年年）、真細菌探針EUB338I-III（Amann）雜交之外等人，，1990；Daims等人，1999年）用作陽性對照，無義探針NON338（Wallner等人，1993年）用作非特異性結合的對照。雜交和酪酰胺信號放大如前所述（Ishii等人，2004年）進行，修改在中有詳細描述支持信息S1。使用配備彩色相機（AxioCam HRc，Carl Zeiss，Thornwood，NY，USA）的Zeiss Axio IMAGER MZ落射熒光顯微鏡進行初始成像。使用帶有可調白光激光器的Leica TCS SP8X共聚焦顯微鏡（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）進行SRB-PiBE213 CARD-FISH雜交的共聚焦顯微鏡檢查。
如前所述（Pasteris在組織切片上使用Olympus FV1000 LSM通過表面反射共聚焦顯微鏡對紫色硫細菌細胞中的元素硫包裹體進行成像等，，2001）。簡而言之，488 nm激光線用于從具有478-498 nm檢測窗口的可折射元素硫顆粒產生反射信號，而使用543 nm激光線和自動過濾器收集來自紫硫細菌細胞的自發熒光Alexa546熒光團的設置。
硫化物消耗測定
在的N在50毫升血清瓶中的缺氧過濾器滅菌的原位沼澤水中建立了三份微觀世界，每個小漿果（直徑約1-3毫米）2/CO 2含或不含硫化物頂空(90:10)下，添加至終濃度為1 mM。還建立了含有和不含1 mM硫化物的三次非生物對照，并且僅含有經缺氧過濾消毒的原位沼澤水。微觀世界在28°C下以14小時光照/10小時黑暗循環培養，并通過分光光度法監測可溶性硫化物（Cline，1969年）。
循環微伏安法
使用手動顯微操作器以0.1–1 mm的增量垂直降低玻璃Au-Hg汞齊電極（尖端繪制到約500μm直徑）對收集在50 ml Falcon管中的漿果進行伏安分析。根據Brendel和Luther(概述的方法構建和校準電極1995)。在實驗室中校準電極的O 2、HS-和Mn 2+使用從樣品點收集的水；每個電極的響應在使用前立即通過測量200μM Mn的信號進行檢查，2+并在Meites(之后使用先導離子方法進行校準1965)和Slowey和Marvin-DiPasquale(2012)。電極的尖端被定位成使用這種技術穿透許多漿果。漿果通常在電極尖端能夠穿透之前稍微壓縮，然后漿果本身隨著電極的穿透而移動。因此，不可能進行精確的空間參考，盡管很明顯在單個漿果內部確實發生了多次掃描。使用DLK-60恒電位儀和軟件（Analytical Instrument Systems,Flemington,NJ,USA）在每個位置獲得10個循環伏安圖序列。測量之間的儀器變異通常小于1%。還根據制造商的說明使用Unisense硫化物微傳感器（Unisense，Aarhus，Denmark）獨立測量其他聚集體中的硫化物，假設內部pH值為8（Seitz計算總硫化物等，1993）。
δ硫化物捕獲和SIMS 7f-Geo離子微探針分析34 S的
收集大漿果（直徑0.5-1厘米），沖洗干凈，穿入24號銀絲（99.95%；美國新澤西州弗洛勒姆公園的Surepure Chemetals），并孵育在原位下午4點至第二天上午11點.然后取出漿果，用去離子水沖洗電線并在分析前儲存在氮氣氛下。將導線切片，使用雙面碳帶安裝在玻璃圓上，并濺射涂有10納米的金。在加州理工學院微量分析中心使用Cameca IMS 7f-GEO磁扇形SIMS使用先前描述的方法（例如Fike和Grotzinger，2008年；Fike等人，2008年；Fike等人，2009)并在中有詳細說明支持信息S1。
穩定同位素修正實驗
缺氧、過濾滅菌的原位沼澤水用修正，13 C富集碳酸氫鹽（98原子％13 C，Isotec Sigma-Aldrich，圣路易斯，密蘇里州，美國）最終濃度為10 mM，和34 S富集硫酸鹽（90原子%34 S，Isotec Sigma-Aldrich），最終濃度為28 mM，在水中天然存在的濃度之上（硫酸鹽最初測量為26.5 mM）。將漿果洗去沉淀物并放入血清瓶中孵育，其中硫化物添加到0.5 mM和N 2/CO 2(90:10)頂空。在黑暗或光照（14小時光照/10小時黑暗循環）下，在28°C下培養4天。在10 mM鉬酸鈉存在下也建立了類似的光/暗孵育，以抑制聚集體中硫酸鹽還原細菌的活性。同位素未標記的光和暗對照溫育平行溫育，并且由在沼澤水中天然存在的物質的頂部等量添加標準同位素組成碳酸氫鹽和硫酸鹽組成。
4天后，將漿果從孵化中取出，固定、包埋并切片用于nanoSIMS分析。來自光照條件的漿果被切片到玻璃圓片上，隨后濺射鍍上10納米的金。將連續的暗培養切片在導電ITO方塊上（Dekas和Orphan，2011年）。來自三個黑暗生物復制品（+/-鉬酸鹽和未標記的對照）的幾個漿果被固定并快速冷凍，無需嵌入，以便通過散裝元素分析儀同位素比質譜（EA-IRMS）進行分析。
NanoSIMS樣品制備和成像
使用相差和落射熒光顯微鏡對用于nanoSIMS分析的樣品進行光學映射，以識別PB-PSB1靶細胞的島。未對這些樣品進行FISH和CARD-FISH以保存細胞內元素硫內含物，發現這些內含物在這些協議所需的透化步驟中會被洗掉。在nanoSIMS分析之前，發現目標PB-PSB1細胞具有豐富的細胞內硫包裹體。
2010年和2011年，在加州理工學院微量分析中心的Cameca NanoSIMS 50 L儀器上進行了兩次單獨的為期3天的測量。使用初級Cs+離子束在1.2 pA下收集樣品，對應于約50 nm的標稱光斑尺寸.光束以256×256或512×512像素分辨率在15至30μm大小的方形區域上進行光柵化。所有樣品都預先濺射10-15分鐘以局部去除任何外層或金涂層。同時收集七個次級離子，12 C-、13 C-、12 C 14 N-、12 C 15 N-、31 P-、32 S-、34 S-。NanoSIMS圖像使用“打開MIMS”，一個插件的ImageJ可在線處理http://www.nrims.hms.harvard.edu/NRIMS_ImageJ.php（Gormanns等人。，2012）。每個系列的幀都針對漂移和檢測器死區時間進行了校正，但代表了未針對儀器質量分餾進行校正的原始值。顯示的值是來自每個分析區域的幾個幀的總和。
通過EA-IRMS批量分析硫同位素
原位沼澤水中的硫酸鹽用氯化鋇沉淀（Kolmert等人，2000年），干燥并準備用于EA-IRMS。從三次孵化保存的粉紅色漿果（深色，+/-同位素標記，+/-10 mM鉬酸鈉）在55°C下干燥48小時，并在密封的鋁箔中卷曲。使用ECS 4010元素分析儀（Costech Analytical Technologies,Valencia,CA,USA）與Thermo Finnigan Delta V Plus質譜儀（Thermo Scientific,Waltham,MA,USA）聯用分析樣品的硫同位素組成。硫同位素組成根據NBS-127、IAEA-S1和IAEA-S3進行校準。相對于V-CDT(Vienna Canyon Diablo Troilite)標度，硫同位素值以每密耳(‰)為單位報告。根據幾天內的重復分析，這些硫同位素測量值的重現性<0.3‰(1σ)。
碳固定的放射性碳測定
將五個無沉積物的2毫米直徑漿果的孵化放置在帶有1毫升過濾消毒的原位沼澤水和N小型螺旋蓋管中2/CO 2頂部空間(90:10)的。在環境光、暗或最終濃度為10 mM的鉬酸鈉中，將重復孵育預平衡3小時。還用熱滅活的漿果（煮沸10分鐘）制備了重復的小瓶。就在實驗開始之前，每次孵育都用中和的硫化物修正至終濃度為1 mM，然后加入10μL 14 C碳酸氫鹽的0.01 M氫氧化鈉溶液，標稱比活為250μCi/ml.在由196個紅外發光二極管（λ=850 nm）陣列照明的室溫下，孵育1或4小時后取樣，以確保任何觀察到的碳固定來自紫硫細菌，而不是來自含氧光養生物（硅藻、藍藻）)在漿果中。
通過添加1 ml飽和尿素溶液并加熱至85°C 30分鐘以滅活和分解漿果來終止孵育。通過在玻璃閃爍瓶中將50μL漿果勻漿與400μL冰醋酸在65°C下加熱20分鐘，去除未摻入的放射性碳酸氫鹽。在整個加熱過程中輕輕敲擊小瓶以確保去除邊緣附近的任何冷凝物。將10毫升Universol閃爍混合物添加到樣品中，并使用LS 650多用途閃爍計數器（Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA）將生物質中的酸穩定產物量化為每秒閃爍次數。
致謝
我們要感謝多年來在海洋生物實驗室微生物多樣性課程中為這項研究做出貢獻的許多學生、教員和講師的出色工作；我們特別感謝Cristina Moraru和Rebekah J.Ward在開發嵌入和CARD-FISH協議方面提供的幫助、Jarrod J.Scott提供2007年的16S rRNA基因序列數據以及Alexander P.Petroff的有益討論。非常感謝Douglas C.Nelson和Susan E.Alford在放射性碳固定分析方面的工作，Abigail Green-Saxena和Yunbin Guan協助nanoSIMS數據采集，Fotios C.Kafantaris進行微伏安測量工作，Jennifer Houghton Julie Huber使用感謝她的實驗室和Claire Beaudoin進行硫化物微傳感器測量，感謝Nanelle R.Barash和Annette R.Rowe對手稿的批判性閱讀。這項工作得到了NSF贈款DEB-1310168、EAR-1124389和EAR-1123391、戈登和貝蒂摩爾基金會(#3306)的贈款以及來自美國加州大學戴維斯分校研究生研究獎學金的Elizabeth G.Wilbanks的支持論文年獎學金、PEO學者獎和NAI/APS天體生物學劉易斯和克拉克基金。這項研究由MBL微生物多樣性課程的參與者進行，并得到了霍華德休斯醫學基金會、戈登和貝蒂摩爾基金會(#2493)、美國國家科學基金會(DEB-0917499)、美國能源部(DE-FG02)的部分支持-10ER13361）和美國宇航局天體生物學研究所。
《鹽堿地沼澤中的光養粉紅色貝類的微量硫循環》——概括 、介紹
